一种鉴定烟草镰刀菌根腐病抗性的方法技术

本发明专利技术提供一种鉴定烟草镰刀菌根腐病抗性的方法，具体采用草酸溶液替代病菌接种，能够很好地区分不同品种对尖孢镰刀菌的抗感性，相比于病菌接种鉴定方法，可以省去病菌培育的时间30天左右；使用苗期的离体叶片，省去了无菌培育烟株的复杂操作；使烟草对镰刀菌根腐病的抗性鉴定不受生长季节限制，任何季节都能展开鉴定工作；鉴定在叶片上进行，减少了土壤中其它菌的干扰，鉴定结果更准确可靠。鉴定结果更准确可靠。鉴定结果更准确可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定烟草镰刀菌根腐病抗性的方法


[0001]专利技术涉及烟草病害鉴定
，具体涉及一种利用草酸鉴定烟草镰刀菌根腐病抗性的方法。

技术介绍

[0002]烟草是重要的经济作物，其病害种类很多，以根茎类病害损失最为严重。长期以来烟草根茎类病害以黑胫病发生较多。近年来，随着连作的面积扩大，根茎类病害日益严重，除了黑胫病外，一种新的病害正在蔓延扩展，即镰刀菌根腐病。黑胫病的发生已经引起了高度的关注，所以在品种培育、抗性鉴定、栽培措施、药物防治等手段上，都有深入的研究。镰刀菌根腐病在烟草上近几年才上升为主要病害，其研究主要集中在病原菌的鉴定、分离等方面，病害的鉴定研究很少见到。
[0003]镰刀菌属于土壤习居菌，种类繁多，分布很广，可侵染多种植物(粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物)引起植物的根腐、茎腐、花腐和穗腐等。镰刀菌产孢能力很强，孢子传播途径很多，除土传外还可以通过空气传播，侵染植物维管束系统，破坏植物的输导组织。许多研究表明镰刀菌在植物的生长发育过程中还产生毒素，造成植物萎蔫死亡。镰刀菌病害在生产上属于防治最困难的重要病害之一，目前主要采用化学防治及生物防治方法，但这些方法的使用因条件限制有一定程度的局限性。化学防治只能以预防为主，植物一旦受到侵染其治病效果甚微。只有充分认识到病原菌对植物的作用机理，才能找到最经济、有效、环保的防治措施。
[0004]研究认为，在河南省引起烟草枯萎病与根腐病的镰刀菌种类较多，其中茄病镰刀菌(F. oxysporum)和尖孢镰刀菌(F.oxysporum)是引起烟草根腐病和枯萎病的主要致病菌。目前，要培育出抗病品种，首先要对资源材料做抗性鉴定，在鉴定的基础上，再进一步进行机理、分子方面的研究。所以准确快速有效的鉴定是对烟草抗源的挖掘、利用和抗病品种选育的首要环节。
[0005]目前，没有镰刀菌根腐病抗性的鉴定标准，在文献中能找到的是在其它研究种关于该病的接种方法，一种是利用镰刀菌粗毒素经提取纯化后处理刚出芽的烟苗(烟草镰刀菌根腐病病菌致病粗毒素的研究，赵杰)；另一种是利用菌饼接种10叶期的烟苗，在烟苗根茎部用接种针针刺伤口，把制好的菌饼贴于伤口处，用脱脂棉蘸取无菌水包裹在接种处(河南烟草镰刀菌的初步分子鉴定，田艳艳)，这两种方法均能达到使烟株发病的目的，但都需要培养病菌，鉴定病菌，严格控制周围其他杂菌的干扰，重复性不好。专利申请CN108085363A公开了一种烟草对烟草镰刀菌根腐病抗性的鉴定方法，具体包括制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基，然后将将尖孢镰刀菌和茄病镰刀菌分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，备用，再制备菌液、培育烟苗、烟苗前处理、调查，最终将烟草幼苗按照抗性进行分级。然而，该专利中马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备需要将马铃薯蒸熟、过滤、加糖搅拌、定容、分装、灭菌，再与琼脂混合，制备过程相对繁琐，且不易保存。

技术实现思路

[0006]本专利技术人在研究烟草镰刀菌根腐病抗性鉴定的过程中，发现使用草酸处理，能够有效、准确、方便地鉴定出烟草镰刀菌根腐病抗性，原料易得、易于处理，并且能够很好地达到鉴定效果，从而完成本专利技术。
[0007]因此，本专利技术提供了一种鉴定烟草镰刀菌根腐病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]步骤一、草酸溶液的配制：将草酸试剂配制成草酸溶液，储存备用；
[0009]步骤二、烟苗培育：在漂浮盘上，按照常规育苗方法，把烟苗培养45天左右，达到7 片真叶；
[0010]步骤三、草酸注射：选取大小均匀的叶片，使用无菌针头在叶片背面均匀扎取伤口，取部分叶片在伤口处注射草酸溶液，取另一部分叶片在伤口处注射等量无菌水作为对照，用无菌脱脂棉包住叶柄防止叶片脱水，放入含适量无菌水的托盘中培养；
[0011]步骤四、抗性鉴定：接种后第6天开始调查发病情况，对叶片上的注射部位进行观察，若相较于注射时的部位没有变化，则该烟草品种为抗病品种；若叶片上的注射位置形成枯斑且有扩散，则该烟草品种为感病品种。
[0012]优选地，步骤一中，所述草酸溶液的浓度为30mM
‑
50mM，优选40mM。
[0013]优选地，步骤一中，所述草酸溶液的储存条件为避光保存，优选保存在棕色瓶中，置于4℃冰箱。
[0014]优选地，步骤三中，对于每种烟苗，可选取四片叶片进行注射鉴定，其中草酸注射三片，无菌水注射一片。
[0015]优选地，步骤三中，所述草酸溶液和无菌水的注射量为5μL。优选地，步骤三中，所述培养在25
‑
30℃，优选28℃，光周期为8/16h条件下进行。
[0016]本专利技术的有益效果是：
[0017]第一，本专利技术直接利用草酸溶液注射替代病菌接种，对烟苗进行烟草镰刀菌根腐病抗性鉴定，具有以下优点：
[0018]1、可以省去病菌培育的时间30天左右；
[0019]2、使用苗期的离体叶片，省去了无菌培育烟株的复杂操作；
[0020]3、烟草对镰刀菌根腐病的抗性鉴定不受生长季节限制，任何季节都能展开鉴定工作；
[0021]4、鉴定在叶片上进行，减少了土壤中其它菌的干扰，鉴定结果更准确可靠。
[0022]第二，与盆栽接种鉴定烟草镰刀菌根腐病抗性的方法相比较，本专利技术的鉴定方法具有如下优点：
[0023]接种叶片，发病条件易于控制，鉴定结果重复性好；叶片处理6天即可得到结果，缩短了接种周期。相较于采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基的培养方法，大大节省了培养基制备过程。此外，本专利技术的方法原料简单，草酸溶液一次可以做大批量进行保存备用，所需空间少，完全实现了低成本，高通量、快速鉴定烟草镰刀菌根腐病抗性的目的，更适宜于烟草育种研究中大批量种质材料镰刀菌根腐病抗性鉴定，以加速抗病种质资源筛选、抗性遗传特性研究、抗病品种的育种与推广应用。
附图说明
[0024]图1示出了实施例1中，四种烟苗利用草酸注射进行镰刀菌根腐病抗性鉴定的结果；
[0025]图2示出了实施例2中，进行带菌麦粒接种和对照接种的烟草品种烟苗生长情况；
[0026]图3示出了实施例2中，尖孢镰刀菌麦粒培养物接种鉴定中，各烟草品种烟苗的根部生长情况。
[0027]具体实施例方式
[0028]为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体的实施例对本专利技术进一步详细说明。
[0029]试验材料
[0030]选择四种供试烟草品种，包括A：小黄金1025；B：中烟100；C：长脖黄；D：664
‑ꢀ
01。
[0031]实施例1：烟草镰刀菌根腐病抗性的鉴定方法
[0032]步骤一、草酸溶液的配制：将市售草酸试剂配制成40mM的草酸溶液，储存在棕色瓶中，置于4℃冰箱备用；
[0033]步骤二、烟苗培育：在漂浮盘上，按照常规育苗方法，把ABCD四种烟苗培养45天左右，达到7片真叶；
[0034]步骤三、草酸注射：选取大小均匀的叶片，使用无菌针头在叶片背面均匀扎取伤口，取本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定烟草镰刀菌根腐病抗性的方法，所述方法包括以下步骤：步骤一、草酸溶液的配制：将草酸试剂配制成草酸溶液，储存备用；步骤二、烟苗培育：在漂浮盘上，按照常规育苗方法，把烟苗培养45天左右，达到7片真叶；步骤三、草酸注射：选取大小均匀的叶片，使用无菌针头在叶片背面均匀扎取伤口，取部分叶片在伤口处注射草酸溶液，取另一部分叶片在伤口处注射等量无菌水作为对照，用无菌脱脂棉包住叶柄防止叶片脱水，放入含适量无菌水的托盘中培养；步骤四、抗性鉴定：接种后第6天开始调查发病情况，对叶片上的注射部位进行观察，若相较于注射时的部位没有变化，则该烟草品种为抗病品种；若叶片上的注射位置形成枯斑且有扩散，则该烟草品种为感病品种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雪君，平文丽，孙计平，孙焕，李芳芳，李耀宇，李旭辉，俎焕新，侯咏，李丽华，
申请(专利权)人：河南省农业科学院烟草研究所，
类型：发明
国别省市：