一种MA105佐剂中脂质含量的测定方法技术

本发明专利技术涉及一种MA105佐剂中脂质成分含量的测定方法，脂质成分包括1,2

【技术实现步骤摘要】
一种MA105佐剂中脂质含量的测定方法


[0001]本专利技术属于医药生物
，具体的，涉及一种MA105佐剂中脂质含量的测定方法。

技术介绍

[0002]本公司重组带状疱疹疫苗(CHO细胞)采用自制MA105佐剂系统，脂质成分包括1,2
‑
二油酰基
‑3‑
三甲基氯化铵丙烷(DOTAP)，二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇，脂质各组分含量为佐剂系统的核心质控指标。以此佐剂系统制备的重组亚单位疫苗中包含的组分较多，需要与其配套的标准含量测定方法，以监控佐剂质量，基于此，提出本专利技术。
[0003]本专利技术同时开发了一种同时测定重组带状疱疹疫苗(CHO细胞)中三种脂质体成分含量的高效液相色谱检测方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术涉及一种MA105佐剂中脂质含量的测定方法，所述MA105佐剂为CN2021116270833所述方法制备得到的免疫佐剂；所述的脂质成分为1,2
‑
二油酰基
‑3‑
三甲基氯化铵丙烷(DOTAP)，二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇；所述的方法包括如下步骤：
[0005](1)供试品预处理，所述预处理步骤包括：用无水乙醇溶解所述佐剂样品中的脂质体组分，将溶解后的脂质体组分置于离心机内，离心去除杂质，取上清液；
[0006](2)使用高效液相色谱法检测各个脂质成分的含量；所述的高效液相色谱法的参数为：
[0007]色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，尺寸4.6
×
250mm，粒径5μm；
[0008]流动相：甲醇
‑
水
‑
TFA(93:7:0.15)；
[0009]流动相流速：1.5ml/min；检测波长：205nm；柱温：50℃；进样量：20μl；采样时间：35min；
[0010]本色谱条件下，DOTAP、胆固醇及DOPC的出峰时间依次约为9～11min、19～21min、28～30min；
[0011]使用外标法以峰面积计算供试品溶液中DOTAP、DOPC及胆固醇的含量。
[0012]进一步的，
[0013]步骤(1)所述的样品预处理步骤中，样品取样量为1.5ml，无水乙醇用量为3.5ml；离心参数为：10000g离心10min；
[0014]步骤(2)所述的高效液相色谱法中，使用外标法计算出DOTAP、DOPC及胆固醇含量的方法为：
[0015]分别以对照品溶液中DOTAP、DOPC及胆固醇各自的峰面积，
[0016]按外标法以峰面积计算供试品溶液中DOTAP、胆固醇和DOPC的含量。
[0017]本专利技术的有益效果是：
[0018](1)采用高效液相色谱法测定重组带状疱疹疫苗中MA105佐剂的脂质成分，具体包
括DOTAP、DOPC及胆固醇的含量，通过无水乙醇处理并离心取上清的方式排除疫苗中其它组分对于检测产生的干扰；
[0019](2)所述方法可以一次检测三种脂质体组分，可进行大批量检测，具有操作简单、灵敏度高、重复性强、准确度高等优势。
附图说明
[0020]图1、供试品的色谱图(图1中，DOTAP、胆固醇及DOPC的出峰时间依次为9.344min、19.974min、28.371min)。
[0021]图2、对照品的色谱图(图2中，DOTAP、胆固醇及DOPC的出峰时间依次为10.415min、20.370min、28.766min)。
具体实施方式
[0022]仪器设备
[0023]Agilent 1260高效液相色谱仪；
[0024]SPOLAR,4.6
×
250mm 5μm C18色谱柱分析柱，艾本德(上海)国际贸易有限公司：
[0025]5425R冷冻离心机
[0026]试剂：
[0027]无水乙醇(HPLC级)，甲醇(HPLC级)，TFA(HPLC级),实验用水为超纯水
[0028]样品：
[0029]重组带状疱疹疫苗，由我司(成都迈科康康生物科技有限公司)自行制备(参见CN2021116270833)。
[0030]实验流程：
[0031]1、样品预处理
[0032]溶解脂质体组分：准确吸取1.5ml供试品至5ml容量瓶，用无水乙醇定容至刻度，混匀。
[0033]去杂质：将溶解后的脂质体组分置于离心机内，10000g离心10min去除杂质，取上清液样品。
[0034]2、对照品贮备液及对照品溶液制备
[0035]对照品贮备液制备：分别称取相应质量的DOTAP、DOPC及胆固醇至对应的100mL容量瓶中，用无水乙醇溶解并定容，混匀，1.5ml/瓶分装，
‑
20℃保存。
[0036]对照品溶液制备：取
‑
20℃保存的DOTAP对照品贮备液、胆固醇对照品贮备液、DOPC对照品贮备液各1瓶，平衡至室温。准确量取DOTAP对照品贮备液、胆固醇对照品贮备液、DOPC对照品贮备液各1.0mL至同一10mL容量瓶中，加入3.0mL纯化水后，用无水乙醇定容至刻度，混匀。
[0037]3、高效液相色谱检测
[0038]高效液相色谱检测过程包括以下步骤：
[0039]打开高效液相色谱，连接色谱分析柱，设置检测参数如下：流动相流速：1.5ml/min；检测波长：205nm；柱温：50℃；进样量：20μl；分析时间：35min。
[0040]配制洗脱流动相甲醇
‑
水
‑
TFA(93:7:0.15)，打开泵开关，令洗脱流动相在1.5ml/
min流速下冲洗色谱柱及UV检测器。
[0041]当色谱工作站中显示压力数值无明显变化时，将预处理的对照品溶液组及样品组进样至高效液相色谱进行分析
[0042]4、结果计算
[0043]分别以对照品溶液中的DOTAP、胆固醇和DOPC峰面积平均值，按外标法以计算供试品溶液中DOTAP、胆固醇和DOPC的含量。
[0044][0045]式中，
[0046]C1为对照品溶液的浓度：
[0047]为对照品溶液的峰面积平均值；
[0048]V1为对照品溶液进样体积；
[0049]A
i
为供试品溶液峰面积；
[0050]V
i
为供试品溶液进样体积；
[0051]N为供试品溶液稀释倍数，N＝10/3。
[0052]供试品报告结果为两次进样检测结果的平均值。
[0053]实施例1、检测方法的精密度
‑
重复性
[0054]取同批供试品，依照上述实验流程步骤1至4平行制备六份样品并进行检测及结果计算，每份样品测试1次，收集DOTAP、DOPC和胆固醇的峰面积。
[0055]检测结果表明重复性中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MA105佐剂中脂质含量的测定方法，所述MA105佐剂为CN2021116270833所述方法制备得到的免疫佐剂；所述的脂质成分为1,2
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二油酰基
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三甲基氯化铵丙烷(DOTAP)，二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)和胆固醇；所述的方法包括如下步骤：(1)供试品预处理，所述预处理步骤包括：用无水乙醇溶解所述佐剂样品中的脂质体组分，将溶解后的脂质体组分置于离心机内，离心去除杂质，取上清液；(2)使用高效液相色谱法检测各个脂质成分的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的高效液相色谱法的参数为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，尺寸4.6
×
250mm，粒径5μm；流动相：甲醇
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水
‑
TFA的比例为93:7:0.15；流动相流速...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈静，方习静，张欢，
申请(专利权)人：成都华任康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：