一种巯基化透明质酸衍生物中二硫苏糖醇残留的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种巯基化透明质酸衍生物中二硫苏糖醇残留的检测方法，包括以下步骤：配制DTT标准品工作液；DTT标准品经凝胶渗透色谱检测获得对应的标准曲线；配制待测样品工作液；待测样品工作液经凝胶渗透色谱检测，获得样品中二硫苏糖醇的残留含量。本发明专利技术样品无需处理，操作方法简单易行，DTT在1～20 ppm范围内有良好的线性范围（其线性相关系数（R2）为0.9994），最低检测限可达到1 ppm（信噪比3.67），定量限可达到2.72 ppm（信噪比10），准确度高（回收率（R）在105.6%～111.9%之间（RSD为3%）），能够满足实际检测中的需要。能够满足实际检测中的需要。能够满足实际检测中的需要。

【技术实现步骤摘要】
一种巯基化透明质酸衍生物中二硫苏糖醇残留的检测方法


[0001]本专利技术涉及二硫苏糖醇检测
，特别涉及一种巯基化透明质酸衍生物中的二硫苏糖醇残留的检测方法。

技术介绍

[0002]透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)，又名“玻璃酸”，广泛分布于动物和人体的细胞外基质中，是细胞基质和多种组织的重要组成成分，具有多种重要的生理学功能。采用含有二硫键的氨基试剂与透明质酸的侧链羧基进行偶联反应；偶联反应结束后，二硫键可经简单的还原过程还原为自由巯基，即可得到巯基化透明质酸衍生物，这是当前巯基化透明质酸衍生物最为常用的制备方法；在上述二硫键还原为自由巯基的过程中，目前最为广泛使用的还原剂是二硫苏糖醇。
[0003]二硫苏糖醇(Dithiothreitol，简称为DTT)是一种小分子有机还原剂，化学式为C4H
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O2S2。其还原状态下为线性分子，被氧化后变为包含二硫键的六元环状结构。DTT可以将巯基保持在还原态，常用于还原蛋白分子和多肽的二硫键，更普遍用以防止蛋白半胱氨酸残基形成分子内和分子间的二硫键，通常作为蛋白质巯基保护剂。DTT进入体内可能会破坏蛋白质结构，从而引起酶失活等现象，DTT的残余可能导致潜在的安全性隐患，因此需要严格监控过程中样品以及终产品中的还原剂DTT的残留量。
[0004]根据目前报道，采用传统分光光度计法进行测定时，DTT极容易被氧化，响应不稳定，灵敏度低，不能满足检测要求。还有一种基于液相色谱的测试方法是用单溴二胺(mBBr)这种荧光探针对DTT进行衍生，衍生后利用反相液相色谱和荧光检测器对DTT进行定量分析，这种方法灵敏度高，但是样品前处理过程复杂，对反应环境要求严格，不适用于工业生产过程中对DTT残留量的检测。中国专利CN112526028A公开了采用液相色谱串级质谱（LC
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MS/MS）法同时对二硫苏糖醇还原态和氧化态两种共存形式进行定量分析的液相色谱法，但是这种方法需要同时生成两种物质的标准曲线，增加检测工作量。还有报道利用钴离子反滴定的方法测定DTT含量，但是DTT容易被氧化，而且这种方法灵敏度也不高。中国专利CN107255660B公开了利用石墨烯量子点电极来检测溶液中二硫苏糖醇的方法，这种方法操作简单，灵敏度高，但是限于其制备工艺高昂的价格，工业生产中应用较少。
[0005]目前也有用HPLC对二硫苏糖醇(DTT)残留量进行定量的报道，例如：高效液相色谱法测定药品中的二硫苏糖醇和氧化型二硫苏糖醇（分析科学学报 2016, 32:537
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540）采用HPLC测定了工程菌代谢产物（一种活性蛋白）中DTT的含量，采用了Waters X
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Bridge C18色谱柱，流动相为30:70（v/v）的甲醇
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水；反相高效液相色谱法检测重组类病毒颗粒疫苗原液中二硫苏糖醇的残留量（中国生物制品学杂志2015, 28:1316
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1319）采用反相HPLC测定了重组HPV疫苗原液中DTT的残留量，采用了DIKMA Bio
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Bond C18色谱柱，流动相为90:10（v/v）水
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乙腈（0～10 min）、100%乙腈（10～15 min）和90:10（v/v）水
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乙腈（15～20 min）。但上述的活性蛋白和重组HPV疫苗均具有明确的单一分子量蛋白结构，而本申请涉及的巯基化透明质酸衍生物为具有分散性的大分子多糖衍生物混合体，研究表明上述两种检测方法很
难满足巯基化透明质酸衍生物中微量DTT残留分离检测的实际需求。
[0006]在巯基化透明质酸衍生物的制备中，二硫苏糖醇的残留定量检测已成为一个亟待解决的问题，现今尚没有巯基化透明质酸衍生物中DTT微量残留的检测方法，这为其在药物或者医疗器械的广泛应用带来了限制，建立一种有效的巯基化透明质酸衍生物中DTT微量残留的检测方法具有重要意义。

技术实现思路

[0007]本专利技术要解决的技术问题是提供一种精确度较高、能够满足实际需求的巯基化透明质酸衍生物中二硫苏糖醇残留的检测方法，一种二硫苏糖醇残留的凝胶渗透色谱检测方法。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供一种巯基化透明质酸衍生物中二硫苏糖醇残留的检测方法，包括以下步骤：步骤（1）标准品工作液：精密称取一定量的DTT标准品，以pH 3.5～4.5的磷酸盐缓冲液为稀释剂 ，配制成不少于4个浓度梯度、范围为1～20 ppm的DTT标准品工作液；步骤（2）待测样品工作液：精密称取一定量的巯基化透明质酸衍生物，以pH 3.5～4.5的磷酸盐缓冲液为稀释剂，配制浓度范围为3～20mg/ml巯基化透明质酸衍生物溶液；步骤（3）标准曲线：步骤（1）的标准品工作液依次经凝胶渗透色谱检测，分别获得对应的二硫苏糖醇的峰面积，并与标准品工作液浓度进行线性回归产生标准曲线，或由软件系统自动生成标准曲线；步骤（4）待测样品测定：步骤（2）的待测样品工作液经凝胶渗透色谱检测，获得样品的二硫苏糖醇的峰面积，代入至步骤（3）的标准曲线，计算得到待测样品中二硫苏糖醇的残留含量；步骤（2）、步骤（4）所述的凝胶渗透色谱检测采用的是Water 2695
‑
2998液相色谱仪；水相凝胶渗透色谱柱的型号是Ultrahydrogel
TM 120，7.8
×
300mm，填料粒径 6
µ
m；柱温：30℃。
[0009]具体的，所述凝胶渗透色谱的进样量为10～100
ꢀµ
l；流速为0.5～1.0 ml/min。
[0010]具体的，所述凝胶渗透色谱的流动相为pH 3.5～4.5的磷酸缓冲盐与乙腈的混合溶液。
[0011]具体的，所述磷酸盐缓冲液和乙腈的体积比为85:15～95:5。
[0012]具体的，所述流速为0.7 ml/min。
[0013]具体的，所述进样量为40
µ
l。
[0014]具体的，所述凝胶渗透色谱的检测器是光电二极管阵列检测器。
[0015]具体的，所述凝胶渗透色谱的检测波长是210nm。
[0016]具体的，所述标准品工作液的浓度梯度分别为1、2、5、10和20ppm。
[0017]具体的，所述巯基化透明质酸衍生物的分子量大于120 KDa。
[0018]凝胶渗透色谱（GPC）仪的组成:泵系统、(自动)进样系统、凝胶色谱柱、检测系统和数据采集与处理系统。与高效液相色谱法（HPLC）检测类似，GPC检测方法具有定量准确、检测周期短等优点，是较为适于微量检测的方法之一。HPLC通过色谱柱进行样品分离，色谱柱中充满非常微小的凝胶颗粒填料，基于被分离物质中各种分子与凝胶颗粒填料之间的亲和力而实现分离。而GPC的分离原理是体积排阻理论，其凝胶渗透色谱柱中所填装的多孔性填料表面及内部有各种各样大小不一的多孔通道，基于被分离物质中各种分子的分子尺寸差异而实现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种巯基化透明质酸衍生物中二硫苏糖醇残留的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤（1）标准品工作液：精密称取一定量的DTT标准品，以pH 3.5～4.5的磷酸盐缓冲液为稀释剂，配制成不少于4个浓度梯度、范围为1～20 ppm的DTT标准品工作液；步骤（2）标准曲线：步骤（1）的标准品工作液依次经凝胶渗透色谱检测，分别获得对应的二硫苏糖醇的峰面积，并与标准品工作液的浓度进行线性回归产生标准曲线，或由软件系统自动生成标准曲线；步骤（3）待测样品工作液：精密称取一定量的巯基化透明质酸衍生物，以pH 3.5～4.5的磷酸盐缓冲液为稀释剂，配制浓度范围为3～20 mg/ml巯基化透明质酸衍生物溶液；步骤（4）待测样品测定：步骤（3）的待测样品工作液经凝胶渗透色谱检测，获得样品的二硫苏糖醇的峰面积，代入至步骤（2）的标准曲线，计算得到待测样品中二硫苏糖醇的残留含量；步骤（2）、步骤（4）所述的凝胶渗透色谱检测采用的是Water 2695
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2998液相色谱仪；水相凝胶渗透色谱柱的型号是Ultrahydrogel
TM 120，7.8
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300m...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红晨，谢健，蔡娜，谢惠芬，王云云，舒晓正，
申请(专利权)人：常州百瑞吉生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：