基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG-I激活检测的方法技术

本发明专利技术属于RIG

【技术实现步骤摘要】
基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
‑
I激活检测的方法


[0001]本专利技术属于RIG
‑
I激活检测
，尤其涉及一种基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
‑
I激活检测的方法。

技术介绍

[0002]蛋白RIG
‑
I（视黄酸诱导基因I，retinoic acid
‑
inducible gene I）是天然免疫系统中的重要分子，为基因DDX58（DExD/H
‑
Box Helicase 58）所编码。RIG
‑
I蛋白的主要功能是结合并识别细胞质中的RNA，当识别到非自身的RNA时激活，触发干扰素产生通路。
[0003]RIG
‑
I蛋白可分为三个结构域，从氨基端到羰基端依次为CARD结构域（caspase蛋白招募结构域，caspase recruitment domain），解旋酶结构域和RNA结合结构域。在静息状态下，RIG
‑
I蛋白的CARD结构域与解旋酶结构域相互作用，即使其RNA结合结构域与自身RNA结合，也不会引起CARD结构域的解离和活性位点暴露。RIG
‑
I蛋白一旦识别到非自身的RNA，便会引起蛋白质构象变化，解旋酶结构域、RNA结合结构域和非自身RNA形成较为牢固的复合体，并导致CARD结构域的解离和活性位点暴露。
[0004]根据该原理，Stephen Cusack等人在文章（文献1：Kowalinski E, Lunardi T, McCarthy AA, Lou+ber J, Brunel J, Grigorov B, Gerlier D, Cusack S. Structural basis for the activation of innate immune pattern
‑ꢀ
recognition receptor RIG
‑
I by viral RNA. Cell. 2011 Oct 14; 147(2): 423
‑
35.）中，使用纯化的仅含CARD结构域的蛋白和仅含解旋酶结构域的蛋白，通过体外的蛋白质沉降实验，验证了两者在没有RNA作用下处于未激活的结合状态（附图1，泳道6对比泳道4，dRIG
‑
I
‑
Hel位置条带）。而当向该体系中加入RIG
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I激活配体双链短RNA时，仅含CARD结构域的蛋白和仅含解旋酶结构域的蛋白会解离（附图1，泳道8对比泳道6，dRIG
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I
‑
Hel位置条带），重现了RIG
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I蛋白激活时的构象变化。该方法可以通过两个蛋白是否解离，判断所添加物是否能激活RIG
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I。
[0005]附图1，为蛋白dRIG
‑
I
‑
Hel（解旋酶结构域）单独或与带his标签的蛋白hisCARDs（CARD结构域）、蛋白hisCARDs和双链短RNA、带his标签的蛋白hisCTD（RNA结合结构域）共孵育，然后用镍柱填料将带his标签的蛋白纯化分离制得样品，通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS
‑
PAGE）和全蛋白染色对样品中蛋白进行分析，所得的实验结果。
[0006]由上可知，该方法应用于大规模RIG
‑
I激活剂的筛选略显不足。主要缺陷为：1.文中所使用RIG
‑
I序列的是来源于禽类，与人类的序列有所差异；2.文中主要的鉴定方法采用镍柱填料纯化，再加上变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS
‑
PAGE）和全蛋白染色分析，通量小且结果不能准确量化；3.文中使用的蛋白浓度在4
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5uM，单个反应蛋白质需求量较大，成本较高；4.文中使用的反应体系不能体现生理条件下的环境影响，特别是溶液中ATP和镁离子作为RIG
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I的辅助因子的作用。
[0007]另外，依据同样的原理，T. H. Dickey（文献2：Dickey TH, Song B, Pyle AM. RNA binding activates RIG
‑
I by releasing an autorepressed signaling domain. Sci Adv. 2019 Oct 2;5(10):eaax3641.）开发了基于荧光能量共振转移的测定RIG
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I体外
激活的方法。作者在RIG
‑
I蛋白紧挨CARD结构域的C端，插入了含有四半胱氨酸的片段，以标记荧光素FlAsH；同时，通过氨基酸密码子置换将位于解旋酶结构域的494位谷氨酸残基替换为叠氮基苯丙氨酸，再经由化学反应标记上荧光素Alexa Fluor 594。改造后的蛋白在静息状态下，能够发生能量转移产生较高的信号。再通过不同RNA处理后，RIG
‑
I激动剂组中信号有不同程度降低，表示RIG
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I的体外激活。
[0008]参见图2，示出了荧光标记的RIG
‑
I与不同RNA共孵育后信号的改变。U55，长度为55个碱基的多聚尿嘧啶；SLR，5
’‑
三磷酸修饰的茎环结构RNA，数字代表双链RNA的长度；pppNS，5
’‑
三磷酸修饰的线性RNA；OH
‑
SLR14，5
’‑
未修饰的茎环结构RNA，双链长度为14个碱基；p(I:C)，聚肌胞苷酸。
[0009]然而，该方法仍旧存有以下不足。主要为：1.文中所使用的氨基酸替换需要使用tRNA改造的大肠杆菌进行蛋白表达，而该菌株尚未商业化应用，因此技术实现有一定难度；同时，局限于该方法，所表达的蛋白缺乏真核生物的蛋白修饰；2.文中RIG
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I蛋白表达后要进行两步的荧光素标记，反应时间较长，对蛋白的活性会有潜在不利影响；3.文中给出的RIG
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I激活的信号变化不超过60%，信号窗口较小。

技术实现思路

[0010]本专利技术提供基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
‑
I激活检测的方法，其具有快速高通量的测定潜力、良好的信号检测窗口及显著的激动剂对RIG
‑
I活性的影响。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术采用以下的技术方案：基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
‑
I激活检测的方法，其特征在于，所述方法通过将RIG
‑
I蛋白分为CARD结构域片段和解旋酶结构域片段，并以二者片段的结合程度反应RIG
‑
I的活性，同时采用均相时间分辨荧光技术对RIG
‑
I的活性进行量化。
[0012]一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：S10：将纯化的仅含CARD结构域的蛋白片本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
‑
I激活检测的方法，其特征在于，所述方法通过将RIG
‑
I蛋白分为CARD结构域片段和解旋酶结构域片段，并以二者片段的结合程度反应RIG
‑
I的活性，同时采用均相时间分辨荧光技术对RIG
‑
I的活性进行量化。2.根据权利要求1所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
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I激活检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S10：将纯化的仅含CARD结构域的蛋白片段与仅含解旋酶结构域的蛋白片段共稀释于溶解有RIG
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I激动剂或待检测物的缓冲液中；S20：对CARD结构域片段和解旋酶结构域片段进行荧光抗体标记；S30：读取反应体系激发后的荧光信号并经计算转换成RIG
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I的活性值。3.根据权利要求2所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
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I激活检测的方法，其特征在于，在步骤S10中，所述缓冲液包括用于稳定反应体系酸碱度的酸溶液、用于模拟生理环境盐度的金属盐溶液、用于模拟细胞内低氧分压环境的还原剂、用于模拟细胞内高浓度蛋白环境的牛血清白蛋白及用作RIG
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I辅助因子的ATP与镁盐溶液。4.根据权利要求3所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
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I激活检测的方法，其特征在于，所述ATP的添加浓度位于2~5mM之间。5.根据权利要求2所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
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I激活检测的方法，其特征在于，在步骤S20中，所述CARD结构域片段和解旋酶结构域片段预先融合用于蛋白纯化和后续抗体标记的标签，所述用于蛋白纯化的标签不能干扰后续抗体的识别或者利用蛋白酶纯化后进行切除；所述CARD结构域片段和解旋酶结构域片段需要各自融合不同的标签用于抗体的识别，各识别标签的抗体之间不存在交叉反应，且均不与RIG
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I存在交叉反应；以及选择的抗体均含有荧光素标记，且荧光素对可产生能量共振转移现象。6.根据权利要求5所述的基于均相时间分辨荧光技术的体外RIG
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I激活检测的方法，其特征在于，用于纯化目的的融合标签选自GST、多聚组氨酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：林晓曦，徐剑锋，袁媛，
申请(专利权)人：上海诚益生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：