利用金纳米花增强信号的双酚S竞争ELISA试剂盒与方法技术

利用金纳米花增强信号的双酚S竞争ELISA试剂盒与方法，该试剂盒包含BPS完全抗原、金纳米花和HRP联合标记的BPS单克隆抗体。利用5

【技术实现步骤摘要】
利用金纳米花增强信号的双酚S竞争ELISA试剂盒与方法


[0001]本专利技术属于环境检测领域，具体涉及一种利用金纳米花增强信号的双酚S竞争ELISA试剂盒与方法。

技术介绍

[0002]双酚S (Bisphenol S, BPS)是一种双酚A(Bisphenol A, BPA)的替代品，因为与BPA相比具有更高的热稳定性和光稳定性，被广泛用于生产聚碳酸酯塑料和树脂。但是随着BPS在“BPA
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free”产品中的使用越来越多，其进入环境的潜力也越来越大，导致BPS在各种环境基质和生物样品中时有检出。如太湖水体中BPS的浓度均值为16 ng/L；中国成人尿液样本(n=160)中BPS的检出浓度为0.24
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g/L。研究表明BPS具有激素活性会干扰生物体正常的内分泌功能。如环境浓度的BPS暴露会对斑马鱼发育和生殖产生毒性效应。另外，母体在低浓度的BPS暴露下会导致子代神经和内分泌系统受损。鉴于BPS在环境中具有较高的浓度和毒性效应，因此亟需建立BPS的检测方法。
[0003]目前BPS的检测方法以高效液相色谱和气相色谱
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质谱法为主，上述方法虽然具有较高的精度和准确性，但是其复杂的样品前处理过程和昂贵的设备等问题使上述方法难以普及，限制了BPS的检测工作。免疫学检测方法是利用抗体对抗原的识别作用对BPS进行检测，其中酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)因为具有快速，灵敏，对设备要求低，成本小等特点，是应用最广泛的免疫学检测方法。虽然已有关于BPS竞争ELISA，但是主要用于食品中BPS的检测工作，且灵敏度有限。而环境样本中，BPS含量较低，检测难度较大，因此需要具有更高灵敏度的BPS检测方法。选择合适的信号放大策略和制备具有高亲和力的抗体是提高ELISA灵敏度的关键。其中金纳米花因为具有金纳米材料相同的生物可利用性、稳定性和纳米酶活性，同时其花状结构能有效增加比表面积，是一种性能优越的信号放大元件。因此本专利技术通过制备了BPS高亲和力和高特异性的单克隆抗体，并将该抗体依次与金纳米花和辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase, HRP)偶联进一步放大检测信号，建立了BPS的竞争ELISA。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种利用金纳米花增强信号的双酚S竞争ELISA试剂盒与方法，利用金纳米花作为信号放大原件，从而建立一种检测BPS的竞争ELISA试剂盒，以弥补现有竞争ELISA检测灵敏度不高的缺点。
[0005]一种利用金纳米花增强信号的双酚S竞争ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒包含BPS完全抗原、金纳米花和HRP联合标记的BPS单克隆抗体；所述BPS完全抗原使用5
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溴戊酸甲酯作为连接臂；所述BPS完全抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原或明胶。
[0006]所述金纳米花和HRP联合标记的BPS单克隆抗体中的BPS单克隆抗体，由所述BPS完全抗原制得。
[0007]所述的试剂盒中，所述BPS完全抗原通过以下方法制得：首先称取0.25 g BPS加入50 mL乙腈中搅拌至完全溶解，随后加入0.415 g碳酸钾反应1 h后，将0.293 g 5
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溴戊酸甲酯加热回流24 h后，移除有机溶剂后将得到的固体过柱(石油醚/乙酸乙酯)纯化，即获得BPS的半抗原；称取10 mg BPS半抗原、8.9 mg碳酰二亚胺(1
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(3
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Dimethylaminopropyl)
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ethylcarbodiimide hydrochloride, EDC)、6.2 mg N
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羟基琥珀酰亚胺(1
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hydroxy
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pyrrolidinedione, NHS)溶于4 mL N,N
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二甲基甲酰胺(N,N
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Dimethylformamide, DMF)中，室温下避光反应2 h；将上述溶液逐滴加入到2 mL 含有20 mg卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)或者15 mg 牛血清白蛋白(Bovine albumin, BSA)的磷酸缓冲液中，4 ℃反应震荡过夜后，6000 r/min离心5 min取上清，置于0.01 M PBS中透析32 h，每8 h更换一次透析液；所得溶液再次离心获得上清液即为BPS
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完全抗原，其中加入卵清蛋白时产物记为BPS
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BSA，作为免疫抗原；加入牛血清白蛋白时产物记为BPS
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OVA作为包被抗原。
[0008]所述的试剂盒中，所述BPS单克隆抗体，是通过以下步骤实现金纳米花和HRP对BPS单克隆抗体的联合标记：首先采用高碘酸钠法将HRP标记于BPS单克隆抗体上，具体方法为将1 mL 5 mg/L HRP溶液与0.2 mL 0.1 M NaIO4溶液充分混合后，室温下震荡20 min；随后放入1 mM 醋酸缓冲液(pH 4.4)中4
°
C透析过夜；液体取出后加入0.5 mL 0.16 M乙二醇溶液，室温摇晃30 min；加入1 mg BPS单克隆抗体混匀，低温摇晃30 min后，放入0.05 M碳酸盐缓冲液(pH 9.5)中透析过夜；液体取出后加入0.1 mL 5 mg/mL NaBH4溶液于4
ꢀ°
C条件下摇晃2 h；随后缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀后于4
°
C摇晃30 min，3000 rpm离心30 min，去除上清液，将沉淀物溶于0.15 M pH=7.4的PBS中并装入透析袋于PBS中4
ꢀ°
C透析除盐；液体取出后3000 rpm离心30 min，去除沉淀物，收集上清液即为HRP标记的BPS单克隆抗体；随后取8 μg HRP标记的BPS单克隆抗体加入1 mL金纳米花溶液中，摇晃1 h后，12000 r/min离心10 min，之后使用0.02 M Tris
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HCl溶液复溶沉淀，获得金纳米花和HRP联合标记的BPS单克隆抗体。
[0009]利用上述试剂盒的BPS间接竞争ELISA检测方法，其特征在于包括下列步骤：步骤1、将根据权利要求1所述试剂盒中的BPS完全抗原用包被液包被于酶标板；步骤2、用封闭液将酶标板封闭；步骤3、将酶标的金纳米花和HRP联合标记的BPS单克隆抗体与待测样本混合加入酶标板中，使得步骤1中包被的BPS完全抗原与待测样本混合，当样本中存在BPS时，样本中的BPS竞争性地结合BPS单克隆抗体。
[0010]专利技术优点目前，通常采用高效液相色谱法和气相色谱法对BPS进行检测，但是这些方法通常需要较昂贵的设备和复杂的样品前处理过程。常规的ELISA方法与化学方法相比虽然具有操作简单，设备要求低，检测速度快的优点，但是其灵敏度较本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用金纳米花增强信号的双酚S竞争ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒包含BPS完全抗原、金纳米花和HRP联合标记的BPS单克隆抗体；所述BPS完全抗原使用5
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溴戊酸甲酯作为连接臂；所述BPS完全抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、纤维蛋白原或明胶。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述金纳米花和HRP联合标记的BPS单克隆抗体中的BPS单克隆抗体，由权利要求1所述BPS完全抗原制得。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述BPS完全抗原通过以下方法制得：首先称取0.25 g BPS加入50 mL乙腈中搅拌至完全溶解，随后加入0.415 g碳酸钾反应1 h后，将0.293 g 5
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溴戊酸甲酯加热回流24 h后，移除有机溶剂后将得到的固体过柱纯化，即获得BPS的半抗原；称取10 mg BPS半抗原、8.9 mg碳酰二亚胺、6.2 mg N
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羟基琥珀酰亚胺溶于4 mL N,N
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二甲基甲酰胺中，室温下避光反应2 h；将上述溶液逐滴加入到2 mL 含有20 mg卵清蛋白或者15 mg 牛血清白蛋白的磷酸缓冲液中，4 ℃反应震荡过夜后，6000 r/min离心5 min取上清，置于0.01 M PBS中透析32 h，每8 h更换一次透析液；所得溶液再次离心获得上清液即为BPS完全抗原，其中加入卵清蛋白时制得的完全抗原记为BPS
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BSA，作为免疫抗原；加入牛血清白蛋白时制得的完全抗原记为BPS
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OVA，作为包被抗原。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述BPS单克隆抗体，是通过以下步骤实现金纳米花和HRP对BPS单克隆抗体的联合标记：首先...

【专利技术属性】
技术研发人员：张振忠，王军，汝少国，滕哈燕，王蔚，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：