一种精子DNA碎片染色试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种精子DNA碎片染色试剂盒及其应用。本发明专利技术的精子DNA碎片染色试剂盒包括磷酸盐缓冲液、瑞氏

【技术实现步骤摘要】
300的有效含量为2～5wt％。
[0012]优选地，所述包被载玻片为包被有0.5～2wt％的琼脂糖水溶液的载玻片。
[0013]更优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为6.4～6.8，其中磷酸盐的含量为0.06mol/L；
[0014]所述瑞氏
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吉姆萨染液为包含0.2wt％瑞氏色素和0.06wt％姬姆氏色素的甲醇溶液；
[0015]所述染色液A为含0.1wt％氯化钠、1.1wt％甘氨酸和0.52wt％冰乙酸的水溶液；
[0016]所述染色液B为含0.6wt％月桂酰肌氨酸钠、3wt％二硫代
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DL
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苏糖醇、4.8wt％三羟甲基氨基甲烷、0.28wt％二水乙二胺四乙酸二钠盐和0.32wt％吐温20的水溶液，其pH值为7.4～7.6；
[0017]所述样本稀释液为0.8wt％的低熔点琼脂糖水溶液。
[0018]本专利技术还提供了上述的精子DNA碎片染色试剂盒的应用，包括在非诊断目的的精子DNA碎片化程度检测中的应用和/或精子质量评估中的应用。
[0019]本专利技术还提供了一种非诊断目的的精子DNA碎片染色方法，采用权利要求上述的精子DNA碎片染色试剂盒进行染色，包括如下步骤：
[0020]步骤1：先将样本稀释液孵育至完全溶化，再将其转移至37℃平衡至少5分钟；
[0021]步骤2：以生理盐水调节精子(新鲜精液或解冻后的冻存精液)浓度至5～10
×
106/mL，取一定量(如60μL)加入上述步骤1所得的样本稀释液中充分混匀，置37℃孵育备用；
[0022]步骤3：在预先冷藏的包被载玻片上，加入一定量上述步骤2得到的精子稀释液，立即盖上盖玻片(迅速操作，勿按压盖玻片)，冷藏(2～8℃下放置5min)使其完全凝固；
[0023]步骤4：以侧抽的方式移除盖玻片，在移除过程中，盖玻片始终紧贴载玻片滑动，不可将盖玻片向上抬离；
[0024]步骤5：在室温(20～30℃)条件下滴加染色液A反应7分钟，弃去染色液A，再滴加染色液B(1～2mL)反应15分钟，弃去染色液B；
[0025]步骤6：将载玻片水平放置于纯化水中5分钟，其间换水1～2次；
[0026]步骤7：将载玻片分别依次置于70％乙醇、90％乙醇和无水乙醇中脱水各2分钟，取出，空气自然干燥；
[0027]步骤8：按实际染色的载玻片数量，取瑞氏
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吉姆萨染液与磷酸盐缓冲液按比例混合得混合染液，每张载玻片滴加混合染液，使之覆盖完全，染色15分钟后，用纯化水从玻片一侧冲洗染料，自然干燥或通风柜内吹干，用显微镜观察精子染色结果。
[0028]优选地，所述步骤1中孵育的温度为80℃，时间为20分钟。
[0029]优选地，所述步骤5中染色液A和染色液B的滴加量为1～2mL。
[0030]优选地，所述步骤8中瑞氏
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吉姆萨染液与磷酸盐缓冲液按1:2的比例混合，所述混合染液的滴加量为1～1.5mL。
[0031]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0032]本专利技术的染色试剂盒利用精子染色质扩散试验原理检测精子DNA碎片程度，结果可靠性、精子染色质量等方面都得到较大的提升；其中，本专利技术的试剂盒中含有染色液B，染色液B中月桂酰肌氨酸钠可以溶解精子内部蛋白，但不影响外部的细胞膜，染色液B处理后可以保留精子尾部特征，因此，染色结果图像清晰，形成的光晕清晰且与头部分界明显，便于判定精子DNA损伤程度，检测时间短，方便操作，可与全自动精子质量分析仪兼容，完成自
动化后可用于大型实验室检测，可以很大程度地提高效率。
附图说明
[0033]图1为本专利技术的精子DNA碎片染色试剂盒应用于染色的效果图。
具体实施方式
[0034]为使本专利技术更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
[0035]实施例
[0036]一种精子DNA碎片染色试剂盒(SCD染色法)，包括磷酸盐缓冲液、瑞氏
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吉姆萨染液、染色液A、染色液B、包被载玻片、样本稀释液、盖玻片。
[0037]所述磷酸盐缓冲液的pH为6.4～6.8，其中磷酸盐的含量为0.06mol/L。所述磷酸盐缓冲液中还包括防腐剂ProClin 300，所述防腐剂ProClin 300的有效含量为2.16％。
[0038]所述瑞氏
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吉姆萨染液为含0.2％瑞氏色素、0.06％姬姆氏色素的甲醇溶液；
[0039]所述染色液A为含0.1％氯化钠、1.1％甘氨酸、0.52％冰乙酸的水溶液；
[0040]所述染色液B为含0.6％月桂酰肌氨酸钠、3％二硫代
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DL
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苏糖醇、4.8％三羟甲基氨基甲烷、0.28％二水乙二胺四乙酸二钠盐、0.32％吐温20且pH值为7.4～7.6的水溶液；
[0041]所述包被载玻片为包被有1％的琼脂糖的水溶液的载玻片；
[0042]所述样本稀释液为含0.8％的低凝胶温度的琼脂糖的水溶液；
[0043]所述磷酸盐缓冲液的制备方法：
[0044]1)取600～800mL纯化水置于1000mL烧瓶中，称取十二水磷酸氢二钠6.424g、磷酸二氢钾6.64g，加入上述烧瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0045]2)使用已校准的pH计检测溶液pH值，6.4～6.8为合格，偏酸用浓磷酸氢二钠调校，偏碱用浓磷酸二氢钾调节。
[0046]3)量取7.2mL的ProClin 300加入上述烧瓶中，搅拌使其完全溶解。
[0047]4)以纯化水定容至1000mL。
[0048]所述瑞氏
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吉姆萨染液的制备方法：
[0049]1)称取2g瑞氏色素、0.6g吉姆萨色素，加入研磨机，加入1000mL甲醇。研磨5分钟，等待1分钟，再次研磨5分钟，待1分钟，再次研磨5分钟；
[0050]2)将定性滤纸置于120mm布氏漏斗，连接1000mL抽滤瓶和循环水式多用真空泵。将步骤1)液体重复抽滤3次。
[0051]3)以甲醇定容至1000mL，转移至棕色瓶保存。
[0052]所述染色液A的制备方法：
[0053]1)取500～600mL纯化水置1000mL烧杯中，称量1g氯化钠、11g甘氨酸、5.2mL冰乙酸，加入1000mL烧杯中，搅拌使其溶解。
[0054]2)转入定容瓶以纯水定容至1000mL，上下颠倒混匀。
[0055]所述染色液B的制备方法：
[0056]1)取600～700mL纯水置1000mL烧杯中，称取6g月桂酰肌氨酸钠、30g二硫代
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DL
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苏糖醇、48g三羟甲基氨基甲烷、2.8g二水乙二胺四乙酸二钠盐，加入烧杯中，搅拌使其溶解，溶液完全透明。再量取3.2mL吐温20加入烧杯中，搅拌使其溶解。
[0057]2)在PH计监测本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种精子DNA碎片染色试剂盒，其特征在于，包括磷酸盐缓冲液、瑞氏
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吉姆萨染液、染色液A、染色液B、包被载玻片、样本稀释液和盖玻片；所述磷酸盐缓冲液的pH为6.0～7.0，其中磷酸盐的含量为0.02～0.2mol/L；所述瑞氏
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吉姆萨染液为包含0.1～0.5wt％瑞氏色素和0.03～0.15wt％姬姆氏色素的甲醇溶液；所述染色液A为含0.05～0.2wt％氯化钠、1.0～10wt％甘氨酸和0.2～2wt％冰乙酸的水溶液；所述染色液B为含0.3～3wt％月桂酰肌氨酸钠、1～10wt％二硫代
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DL
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苏糖醇、2～10wt％三羟甲基氨基甲烷、0.2～2wt％二水乙二胺四乙酸二钠盐和0.2～2wt％吐温20的水溶液，其pH值为7.0～8.0；所述样本稀释液为0.5～2wt％的低熔点琼脂糖水溶液。2.如权利要求1所述的精子DNA碎片染色试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液中还包括防腐剂ProClin 300，所述防腐剂ProClin 300的有效含量为2～5wt％。3.如权利要求1所述的精子DNA碎片染色试剂盒，其特征在于，所述包被载玻片为包被有0.5～2wt％的琼脂糖水溶液的载玻片。4.权利要求1～3中任意一项所述的精子DNA碎片染色试剂盒的应用，其特征在于，包括在非诊断目的的精子DNA碎片化程度检测中的应用和/或精子质量评估中的应用。5.一种非诊断目的的精子DNA碎片染色方法，其特征在于，采用权利要求1～3中任意一项所述的精子DNA碎片染色试剂盒进行染色，包括如下步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡斌，
申请(专利权)人：上海北昂医药科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：