用于灵敏检测和定量生物分子的装置和方法制造方法及图纸

本公开提供了可用于定量生物分子诸如完整蛋白质和核酸的装置、系统、套件和方法。套件和方法。套件和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于灵敏检测和定量生物分子的装置和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年3月25日提交的美国临时专利申请号62/994,431的权益和优先权，该临时专利申请的全部内容据此以引用方式并入。


[0003]本公开提供了可用于定量生物分子诸如完整蛋白质和核酸的装置、系统、套件和方法。

技术介绍

[0004]定量蛋白质生物分析通常通过配体结合测定(LBA)或用于液相色谱(LC)
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质谱(MS)分析的自下而上替代肽方法进行。这两种方法通常可以以互补的方式使用。然而，由于目标分子与表位结合并且不提供结构信息(LBA)或消化成小片段(自下而上LC
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MS)，因此无法确定分子的代谢转化。
[0005]为了满足这一需求，分析人员可以改为利用MS检测来检测和定量完整蛋白质。高分辨率质谱(HRMS)的最新技术进步加上样品制备的改进使得可以使用反相液相色谱(RPLC)来进行完整蛋白质的生物分析。与替代方法不同，对完整蛋白质进行RPLC
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HRMS可以提供关于在任何给定测定中准确定量的内容的更完整的图片。另外，由于相关方法中不使用消化或仅使用有限量的消化，因此可以减少样品制备时间。然而，对这种分析模式的新兴尝试已显示，在LC和MS尺寸两者均未适当优化的情况下，完整蛋白质定量可能相当具有挑战性。

技术实现思路

[0006]本公开提供了解决与生物分子定量(包括完整蛋白质定量)(其中通过采用具有优化的固定相和流动相的短柱装置难以在不损失固定相(即吸附剂颗粒)或柱硬件的情况下实现良好的分辨率和高蛋白质回收率)相关的挑战的装置、系统、套件和方法。本公开还解决了长时间运行不利于高通量、完整质量分析的问题。本公开进一步提供了用于获得质谱灵敏度以进一步改进检测的有用的LC和MS方法。
[0007]在各个方面，本公开提供了包括色谱分离装置的色谱系统，该色谱分离装置包括(a)吸附剂颗粒，该吸附剂颗粒具有0.5μm至100μm范围内的宽度，以及(b)外壳，该外壳包括入口、出口和入口与出口之间的内部容积，该内部容积(i)填充有具有5mm至50mm范围内的长度和50μm至10mm范围内的宽度的吸附剂颗粒的体积，或者(ii)被构造成填充有具有5mm至50mm范围内的长度和50μm至10mm范围内的宽度的吸附剂颗粒的体积，其中从外壳的入口到出口的流体流动方向沿着吸附剂颗粒的体积的长度。吸附剂颗粒的体积在本文中也称为床体积。
[0008]在可以与上述方面结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的体积的长度与宽度的比率在10∶1至2∶1范围内，有利地在8∶1至2∶1范围内。
[0009]在可以与上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒是例如包含至范围内(例如，至至至至至至至至任何范围内(换句话讲，介于任何两个前述值之间的范围内))的孔径的多孔颗粒。
[0010]在可以与任何上述方面结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒是非多孔颗粒。
[0011]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒是球形颗粒。
[0012]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的宽度在1.5μm至5μm范围内。
[0013]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的体积具有5mm至20mm范围内的长度。
[0014]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的体积具有1mm至5mm范围内的宽度。
[0015]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒的体积是圆柱形体积(在这种情况下，吸附剂颗粒的体积的宽度对应于圆柱形体积的直径)。
[0016]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，吸附剂颗粒包含有机聚合物。在这些实施方案中的一些中，有机聚合物包含至少一种疏水性有机单体。疏水性单体的具体示例包括例如单官能和多官能芳族单体(诸如苯乙烯和二乙烯基苯)、单官能和多官能烯烃单体(诸如乙烯、丙烯或丁烯、聚碳酸酯单体、对苯二甲酸乙二醇酯)、单官能和多官能氟化单体(诸如氟乙烯、1，1
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二氟乙烯、四氟乙烯、氯三氟乙烯、六氟丙烯、全氟丙基乙烯基醚或全氟甲基乙烯基醚)、单官能或多官能丙烯酸酯单体、单官能或多官能甲基丙烯酸酯单体或它们的任何组合等。在特定实施方案中，有机聚合物包括甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、二乙烯基苯或它们的任何组合，在一些实施方案中，苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物是优选的。
[0017]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，外壳是色谱柱。
[0018]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，包围吸附剂颗粒的体积的外壳的内表面具有小于60
°
的水接触角。
[0019]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，包围吸附剂颗粒的体积的外壳被真空护套或加热单元包围。此类外壳(包括真空护套柱和加热柱)的示例在授予Fogwill等人的美国专利申请号2019/0317062中描述，该美国专利申请据此以引用方式并入。
[0020]例如，在这些实施方案中的一些中，柱可包括绝缘构件和/或护套。在各种实施方案中，绝缘构件可由包围柱的真空室形成。在一些实施方案中，绝缘构件可包括其中布置有气体的真空室。在一些实施方案中，气体可以是氦、氢、氖、氮、氧、二氧化碳、氩、六氟化硫、氪和氙中的任何一种。在一些实施方案中，真空室可包含大气气体。在一些实施方案中，柱和绝缘构件可集成到形成绝缘色谱柱的单个部件中。例如，护套可包围柱并且真空室可形成在柱与护套之间的区域中。在一些实施方案中，护套可由钢制成。形成绝缘构件的真空室可为柱提供热绝缘。绝热构件可基本上防止在柱内形成径向热梯度。
[0021]在这些实施方案中的一些中，柱的至少一部分可布置在加热器内，或者柱可布置
在加热器的外部。另选地或另外，加热器可与柱串联布置，使得流动相在到达柱之前通过加热器。在示例性实施方案中，可提供各种传感器(诸如温度传感器)以监测进入柱和/或离开柱的流动相的温度。在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，色谱系统进一步包括检测器。在各种实施方案中，色谱分离装置的出口直接连接到检测器。在这些实施方案中的一些中，色谱分离装置和检测器设置在单个装置中。这种构造(特别地，柱直接联接到质谱仪离子源装置(诸如电喷射离子化发射器))的示例在授予Fogwill等人的美国专利申请号2019/0317062中描述。
[0022]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，检测器是荧光检测器或者基于UV、可见光和/或近IR光等的检测器。
[0023]在可以与任何上述方面和实施方案结合使用的各种实施方案中，检测器是质谱仪。在这些实施方案中的某些中，质谱仪是基于四极杆的质谱仪和/或离子迁移质谱仪和/或基于飞行时间本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于分离完整蛋白质的方法，所述方法包括：将包含所述完整蛋白质的溶液引入色谱分离装置的外壳入口，所述色谱分离装置包括(a)吸附剂颗粒，所述吸附剂颗粒由有机聚合物形成并且具有0.5μm至100μm范围内的宽度，所述有机聚合物由一种或多种单官能或多官能芳族单体形成，以及(b)外壳，所述外壳包括所述外壳入口、外壳出口和所述外壳入口与所述外壳出口之间的内部容积，所述内部容积被填充有具有2mm至50mm范围内的长度和50μm至10mm范围内的宽度的所述吸附剂颗粒的体积，其中从所述外壳入口到所述外壳出口的流体流动方向沿着所述吸附剂颗粒的所述体积的长度，并且其中所述吸附剂颗粒的所述体积的长度与宽度的比率在10∶1至2∶1范围内，由此将所述完整蛋白质加载到所述吸附剂颗粒上；以及将包含甲酸、乙酸和/或氟化羧酸的酸性流动相以足以在来自所述色谱装置的所述外壳出口的洗脱液流中从所述吸附剂洗脱所加载的完整蛋白质的至少一部分的体积引入所述色谱分离装置的所述外壳入口中。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种单官能或多官能芳族单体包括苯乙烯和二乙烯基苯。3.根据权利要求1
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2中任一项所述的方法，其中所述吸附剂颗粒是具有至范围内的孔径的多孔颗粒或表面多孔颗粒。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述外壳的所述内部容积的内表面具有小于60
°
的水接触角。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中所述流动相还包含一种或多种极性有机溶剂。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的方法，其中在洗脱过程期间，所述流动相的组成发生改变。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述流动相还包含一种或多种极性有机溶剂和水。8.根据权利要求7所述的方法，其中在洗脱过程期间，所述流动相中所述水的浓度降低，并且所述流动相中所述极性有机溶剂的浓度增加。9.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中在洗脱过程期间，所述流动相的温度升高。10.根据权利要求1
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7中任一项所述的方法，其中在所述洗脱过程期间，(a)将恒定温度分布与多等度流动相组成分布联合，(b)将温度梯度与多等度流动相组成分布联合，(c)将多等度温度分布与恒定流动相组成联合，(d)将多等度温度分布与流动相组成梯度联合，或(e)将多等度温度分布与多等度流动相组成分布联合。11.根据权利要求1
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10中任一项所述的方法，所述方法还包括用检测器分析所述洗脱液流。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述检测器是荧光检测器。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述检测器是质谱仪。14.根据权利要求11所述的方法，其中所述检测器是基于四极杆的质谱仪，并且其中所述四极杆用作质量过滤器。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述四极杆用于滤除m/z值小于1,000的离子。16.根据权利要求13
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15中任一项所述的方法，其中所述吸附剂颗粒的所述体积在10μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：沃特世科技公司，
类型：发明
国别省市：