一种含间充质干细胞外泌体的冻干粉及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提出了一种含间充质干细胞外泌体的冻干粉及其制备方法和应用，属于医学美容技术领域。将大鼠脂肪间充质干细胞传代培养，加入含双氧水、脂多糖、血小板衍生因子组合物和无外泌体血清的DMEM培养液中培养，然后通过不同的的径迹蚀刻膜，滤液离心，沉淀在PBS中重悬，加入乳化剂和海藻酸钠，加入含有白藜芦醇的食用油中，乳化，滴加钙离子溶液固化，干燥，得到含脂肪间充质干细胞外泌体的缓释微球。本发明专利技术的冻干粉能减少受损皮肤的炎症细胞浸润，增加新生血管形成，促进皮肤修复，恢复及提高皮肤弹性，抑制皮肤瘢痕、痘痕等的生成，恢复皮肤弹性、抚平细纹、美白肌肤等效果，提高皮肤抗损伤、抗炎、抗敏的能力，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种含间充质干细胞外泌体的冻干粉及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及医学美容
，具体涉及一种含间充质干细胞外泌体的冻干粉及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]外泌体(Exosome)是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径大约30
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150nm，具有脂质双层膜结构，携带RNA和蛋白质，被大多数细胞类型释放，是细胞间通讯系统的一部分。几乎所有的细胞都分泌胞外囊泡，包括间充质干细胞，间充质干细胞来源的胞外囊泡含有与母细胞相似的成分，如细胞因子、生长因子、脂类、mRNAs及调控型miRNAs等。他们主要参与细胞与细胞间的交流通讯及改变组织的微环境等，在免疫调控，组织损伤修复等方面起着不可低估的作用。
[0003]间充质干细胞(MSCs)是基质来源的成体干细胞，主要存在于骨髓、牙髓、脂肪、脐带等结缔组织和器官间质中。干细胞分泌的外泌体指的是直径在30
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150nm的同质性囊泡，由与细胞质膜相同的脂质双分子层包裹，内部含有蛋白质和RNA等生物活性物质。间充质干细胞(MSCs)以旁分泌方式发挥作用，其机制为干细胞通过产生大量细胞因子和生长因子，以及产生外泌体(exosomes)来起到组织修复的作用。目前干细胞广泛应用于组织修复及缺血性疾病治疗领域。研究发现，干细胞分泌的外泌体能模拟干细胞的生物学功能，也逐渐被证实能促进组织修复和治疗一些难治性疾病，具有广阔的应用前景。与干细胞相比，作为其旁分泌物的干细胞外泌体具有更稳定的生物特性，有研究表明外泌体在
‑r/>80℃保存2年仍能保持其生物学功能。在体内实验中外泌体的脂质双分子层结构能防止其内容物降解，保持内部蛋白及遗传物质的活性，并且与干细胞分泌的可溶性细胞因子不同，外泌体可直接进入靶细胞，通过向靶细胞转运特异性蛋白、脂质及RNA等生物活性物质，来诱导靶细胞的增殖、迁移、血管化等生物学变化，从而改变局部微环境，稳定而持久地发挥多种生物学功能。这种“载体式”信号转导方式使外泌体具备更高更稳定的信号转导效率，且在生物体内不会被细胞外介质稀释。
[0004]越来越多的研究表明，干细胞外泌体可减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学作用。外泌体的这些作用使得其在治疗心肌梗死，皮肤创伤等组织损伤中存在良好的应用前景，并且已经有较多深入的研究。与干细胞的移植治疗相比，干细胞外泌体可以降低细胞移植致瘤风险，因此通过干细胞来源的外泌体进行促进血管生成和增强损伤细胞修复，有望成为组织损伤修复的治疗新策略。外泌体的独特生物学优势也为未来药物载体的研发开启了一条全新的思路。科学家们认为与干细胞相比，使用干细胞分泌的外泌体治疗的安全性更高及可操作性更强。因为干细胞外泌体作为治疗产品具有干细胞制剂不具有的某些特性，例如外泌体相比活细胞而言，成分比较确定，易于质量控制；并且外泌体在体外环境下的稳定性更有利于运输和保存。因此这些特性使得外泌体具有很大的应用价值。
[0005]皮肤覆于机体的表面，富含血管、神经、汗腺等组织。皮肤作为第一道天然屏障直
接与外界接触，能够防止微生物入侵、紫外线损伤等外部刺激。随着化妆品的过度使用，很多人出现了脸部皮肤角质层变薄，易过敏，红肿，易损伤等症状，然而目前市面上没有一款有效的修护产品。外泌体属于天然的脂质体，与人体具有良好的生物相容性。外泌体直径为30
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100nm，是由细胞分泌的一种囊泡，可以直接被靶细胞摄入，广泛参与细胞间的交流活动。但外泌体种类繁多，成分和作用机制目前仍不明确。最新研究发现表达CD63、CD81的间充质干细胞外泌体囊泡能够通过Wnt4促进b
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连环蛋白核转移和增强皮肤细胞的增殖和迁移活性，促进皮肤细胞增殖并抑制细胞凋亡。同时，还能促进血管新生，调节炎症反应，抑制瘢痕形成。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提出一种含间充质干细胞外泌体的冻干粉及其制备方法和应用，能减少受损皮肤的炎症细胞浸润，增加新生血管形成，促进皮肤修复，恢复及提高皮肤弹性，抑制皮肤瘢痕、痘痕等的生成，恢复皮肤弹性、抚平细纹、美白肌肤等效果，提高皮肤抗损伤、抗炎、抗敏的能力，具有广阔的应用前景。
[0007]本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0008]本专利技术提供一种含脂肪间充质干细胞外泌体的缓释微球的制备方法，将大鼠脂肪间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至75
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80％融合时，加入含双氧水、脂多糖、血小板衍生因子组合物和无外泌体血清的DMEM培养液进行培养，然后依次连续通过10μm、5μm、1μm的径迹蚀刻膜，重复3
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5次，滤液在离心力为90000
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110000g下，离心60
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70min，洗涤沉淀，再次在离心力为90000
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110000g下，离心60
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70min，沉淀在无菌PBS中重悬，加入乳化剂和海藻酸钠，混合均匀后，加入含有白藜芦醇的食用油中，乳化，滴加钙离子溶液固化，冷冻干燥，得到含脂肪间充质干细胞外泌体的缓释微球。
[0009]作为本专利技术的进一步改进，包括以下步骤：
[0010]S1.制备培养液：向含无外泌体血清的DMEM培养基中加入双氧水、脂多糖和血小板衍生因子组合物，混合均匀后，灭菌，得到培养液；
[0011]S2.干细胞的培养：将大鼠脂肪间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至75
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80％融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的培养液中，培养，收集培养液；
[0012]S3.膜过滤：将步骤S2收集的培养液依次连续通过10μm、5μm、1μm的径迹蚀刻膜，重复3
‑
5次，分别去除死细胞、细胞碎片和凋亡小体，收集滤液；
[0013]S4.外泌体的分离：将步骤S3制得的滤液在离心力为90000
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110000g下，离心60
‑
70min，收集沉淀用无菌PBS洗涤，再次在离心力为90000
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110000g下，离心60
‑
70min，沉淀在无菌PBS中重悬，得到外泌体
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PBS溶液；
[0014]S5.含脂肪间充质干细胞外泌体的缓释微球的制备：将步骤S4制得的外泌体
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PBS溶液中加入海藻酸钠和乳化剂，得到水相；将白藜芦醇加入食用油中，得到油相；将水相和油相混合后，用SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，滴加氯化钙溶液，搅拌混合，常温固化，冷冻干燥，得到含脂肪间充质干细胞外泌体的缓释微球。
[0015]作为本专利技术的进一步改进，步骤S1中所述培养液中无外泌体血清的含量为7
‑
12wt％，双氧水的含量为0.5
‑
1wt％，脂多糖的含量为3
‑
5wt％；血小板衍生因子组合物的含量为0.7
‑
1.2wt％；步骤S2中所述培养的温本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含脂肪间充质干细胞外泌体的缓释微球的制备方法，其特征在于，将大鼠脂肪间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至75
‑
80％融合时，加入含双氧水、脂多糖、血小板衍生因子组合物和无外泌体血清的DMEM培养液进行培养，然后依次连续通过10μm、5μm、1μm的径迹蚀刻膜，重复3
‑
5次，滤液在离心力为90000
‑
110000g下，离心60
‑
70min，洗涤沉淀，再次在离心力为90000
‑
110000g下，离心60
‑
70min，沉淀在无菌PBS中重悬，加入乳化剂和海藻酸钠，混合均匀后，加入含有白藜芦醇的食用油中，乳化，滴加钙离子溶液固化，冷冻干燥，得到含脂肪间充质干细胞外泌体的缓释微球。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.制备培养液：向含无外泌体血清的DMEM培养基中加入双氧水、脂多糖和血小板衍生因子组合物，混合均匀后，灭菌，得到培养液；S2.干细胞的培养：将大鼠脂肪间充质干细胞进行传代培养，待细胞长至75
‑
80％融合时，用无菌PBS洗涤，加入步骤S1制得的培养液中，培养，收集培养液；S3.膜过滤：将步骤S2收集的培养液依次连续通过10μm、5μm、1μm的径迹蚀刻膜，重复3
‑
5次，分别去除死细胞、细胞碎片和凋亡小体，收集滤液；S4.外泌体的分离：将步骤S3制得的滤液在离心力为90000
‑
110000g下，离心60
‑
70min，收集沉淀用无菌PBS洗涤，再次在离心力为90000
‑
110000g下，离心60
‑
70min，沉淀在无菌PBS中重悬，得到外泌体
‑
PBS溶液；S5.含脂肪间充质干细胞外泌体的缓释微球的制备：将步骤S4制得的外泌体
‑
PBS溶液中加入海藻酸钠和乳化剂，得到水相；将白藜芦醇加入食用油中，得到油相；将水相和油相混合后，用SPG膜进行快速膜乳化，形成乳液，滴加氯化钙溶液，搅拌混合，常温固化，冷冻干燥，得到含脂肪间充质干细胞外泌体的缓释微球。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述培养液中无外泌体血清的含量为7
‑
12wt％，双氧水的含量为0.5
‑
1wt％，脂多糖的含量为3
‑
5wt％；血小板衍生因子组合物的含量为0.7
‑
1.2wt％；步骤S2中所述培养的温度为35
‑
38℃，培养的时间为36
‑
60h，CO2含量为4
‑
6％、O2含量为27
‑
30％，余量为氮气，其中％为体积百分比；步骤S4中所述沉淀和无菌PBS的固液比为1:10
‑
15g/mL；步骤S5中所述外泌体
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PBS溶液、海藻酸钠和乳化剂的质量比为100：20
‑
25:0.1
‑
0.3；所述白芦藜醇在食用油中的含量为3
‑
5wt％；所述氯化钙溶液的浓度为5
‑
7wt％；所述SPG膜的孔隙为2
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5μm；所述乳化剂选自硬脂酰乳酸钠、双乙酰酒石酸单甘油酯、蔗糖脂肪酸酯、蒸馏单甘酯中的至少一种；所述食用油选自菜籽油、花生油、玉米油、大豆油、葵花籽油、橄榄油、亚麻籽油中的至少一种。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述血小板衍生因子组合物包括PDGF
‑
AA、PDGF
‑
BB、PDGF
‑
AB中的至少一种，优选地，为PDGF
‑
AA和PDGF
‑
BB的复配组合...

【专利技术属性】
技术研发人员：顾帅，
申请(专利权)人：顾帅，
类型：发明
国别省市：