一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置及分离方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置及分离方法，其分离装置包括三通管，三通管的三个口分别通过第一管道、第二管道和第三管道连通细胞消化液瓶、分散悬浮液瓶和组织消化瓶；组织消化瓶的一侧设有连通内部的出液口，出液口通过第五管道连接过滤器的一端，过滤器的另一端通过第四管道连通细胞收集瓶。本发明专利技术装置一次连接后即可完成组织的消化，消化细胞的多次分散与悬浮，细胞悬液的过滤与收集，大大提高了细胞的分离效率。无需多次开口操作也极大的降低了操作过程中可能造成的细胞污染风险，对细胞分离时背景环境的要求比传统的细胞分离方法要低很多。相对于传统分离方法具有更好的实用性和适用性。分离方法具有更好的实用性和适用性。分离方法具有更好的实用性和适用性。

【技术实现步骤摘要】
一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置及分离方法


[0001]本专利技术属于非人灵长类动物胚胎组织肾脏原代细胞分离
，具体涉 及一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置及分离方法。

技术介绍

[0002]应对威胁人类的重大传染性疾病，良好的卫生环境、科学的防疫政策和措 施必不可少。目前人类应对突发、多发的病毒性传染疾病，接种预防性疫苗仍 是成本低、见效快、效果好的手段。众所周知，病毒是一种只有在细胞内才能 体现出生物活性的微生物，如今虽然有像mRNA疫苗、腺病毒重组疫苗、DNA 疫苗等多种基于基因工程技术疫苗的不断出现，但是仍然有许多生产工艺、技 术的瓶颈需要去突破。传统的疫苗生产工艺至今仍然是目前广泛采用进行病毒 性疫苗生产最稳定的技术路线。这一技术路线离不开的是宿主细胞的体外分离 及培养技术，最成功的例子就是我国采用恒河猴原代猴肾细胞生产的脊髓灰质 炎减毒活疫苗，为我国和全世界消灭脊髓灰质炎立下了不可磨灭的贡献。动物 肾脏细胞作为一种良好的、多种病毒适应性细胞至今仍然广泛应用于病毒分离 和培养、新型疫苗研发、生产及药品质量控制等诸多领域。因此分离和构建一 株安全、稳定的动物肾脏细胞对于病毒分离培养、疫苗及药物的开发与评价、 药物的检定与质量控制等研究具有重要意义。
[0003]目前对动物原代肾细胞的分离多采用单一的胰蛋白酶进行消化的技术，具 有分离效率低，细胞获得数量少、死细胞数量多、细胞结团率高、操作过程敞 口次数较多、细胞易污染、细胞分离过程对背景环境要求较高等不足。
[0004]
技术实现思路
r/>[0005]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分 离装置及分离方法。
[0006]为了达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0007]提供一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置，包括三通管，三通管的三个 口分别通过第一管道、第二管道和第三管道连通细胞消化液瓶、分散悬浮液瓶 和组织消化瓶；组织消化瓶的一侧设有连通内部的出液口，出液口通过第五管 道连接过滤器的一端，过滤器的另一端通过第四管道连通细胞收集瓶；
[0008]第一管道、第二管道、第三管道、第四管道、第五管道上均设有止血钳； 细胞消化液瓶、分散悬浮液瓶上设有用于通入压空的第一开口和第二开口；细 胞收集瓶上设有用于抽气的第三开口。
[0009]提供一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离方法，应用上述食蟹猴胎猴肾脏原 代细胞分离装置实现，具体包括以下步骤：
[0010]S1、获取怀孕150天的食蟹猴胎猴肾脏、清洗、剪碎，转移至组织消化瓶 中，并关闭
第一管道、第二管道、第三管道、第四管道、第五管道上的止血钳；
[0011]S2、将组织消化瓶置于带有加热功能的磁力搅拌器上，打开第一管道、第 三管道、第四管道、第五管道上的止血钳，将细胞消化液瓶中的细胞消化液打 入到组织消化瓶中；
[0012]S3、启动磁力搅拌器，搅拌消化组织块1h；期间每隔20min打开第四管道、 第五管道上的止血钳抽走组织消化瓶中的上清消化液，重新补入新的细胞消化 液；抽取过程须停止搅拌，待组织块自然沉淀后再抽取；
[0013]S4、消化结束后，打开第二管道、第三管道、第四管道、第五管道上的止 血钳，将分散悬浮液瓶中的分散悬浮液打入到组织消化瓶中结束消化；
[0014]S5、分散悬浮5min后关闭磁力搅拌器，待组织块自然沉淀后抽取上清液， 收集细胞、离心、进行冻存或接种培养。
[0015]进一步地，步骤S1中，获取的肾脏组织在30min内完成清洗剪碎并开始消 化。
[0016]进一步地，步骤S2中，加入的细胞消化液与胎猴肾脏组织块的体积质量比 为10:1。
[0017]进一步地，步骤S2中，细胞消化液包括0.1％II型胶原酶和0.1％IV型胶原 酶与0.25％胰蛋白酶，其体积比为40：40：20。
[0018]进一步地，步骤S4中，分散悬浮液包括RMP1640、双抗、3％谷氨酰胺、 6.6％碳酸氢钠、新生牛血清，其体积比为88：2：3：3：4。
[0019]本专利技术的有益效果为：
[0020]1、本专利技术采用的是非人灵长类动物食蟹猴，所获得细胞为胎猴的猴肾细胞， 而目前对于动物组织原代细胞分离的研究多采用啮齿类动物。啮齿类动物与人 类亲缘关系较远，所获得细胞用于人用药物的开发与评价效果不如猴肾细胞理 想。
[0021]2、本专利技术提供了一种采用胶原酶与胰蛋白酶的混合溶液进行肾脏组织的消 化，降低胰蛋白酶的使用量，在保证消化效率的前提下大大提高了所获得细胞 的成活率。
[0022]3、本专利技术装置一次连接后即可完成组织的消化，消化细胞的多次分散与悬 浮，细胞悬液的过滤与收集，大大提高了细胞的分离效率。无需多次开口操作 也极大的降低了操作过程中可能造成的细胞污染风险，对细胞分离时背景环境 的要求比传统的细胞分离方法要低很多。相对于传统分离方法具有更好的实用 性和适用性。
附图说明
[0023]图1为本专利技术实施例1装置整体结构示意图；
[0024]其中：1、第一管道；2、第二管道；3、第三管道；4、细胞消化液瓶；5、 分散悬浮液瓶；6、组织消化瓶；7、出液口；8、第四管道；9、过滤器；10、 第五管道；11、细胞收集瓶；12、止血钳；13、第一开口；14、第二开口；15、 第三开口；
[0025]图2为本专利技术实施例2食蟹猴胎猴肾脏原代细胞生长情况图；其中，A：0h 细胞生长情况，B：12h细胞生长情况，C：24h细胞生长情况，D：48h细胞生 产情况；
[0026]图3为本专利技术实施例2、对比例1、对比例2三种不同配方细胞消化液所获 得原代细胞总细胞数对比图；
[0027]图4为本专利技术实施例2、对比例1、对比例2三种不同配方细胞消化液所获 得原代细胞活细胞数对比图；
[0028]图5为本专利技术实施例2、对比例1、对比例2三种不同配方细胞消化液所获 得原代细胞细胞活率对比图；
[0029]图6为本专利技术实施例2、对比例1、对比例2三种不同配方细胞消化液所获 得原代细胞细胞团块率对比图。
具体实施方式
[0030]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理 解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的 普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精 神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保 护之列。
[0031]实施例1
[0032]参照图1，一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置，包括三通管，三通管的 三个口分别通过第一管道1、第二管道2和第三管道3连通细胞消化液瓶4、分 散悬浮液瓶5和组织消化瓶6；组织消化瓶6的一侧设有连通内部的出液口7， 出液口7通过第五管道10连接过滤器9的一端，过滤器9的另一端通过第四管 道8连通细胞收集瓶11；
[0033]第一管道1、第二管道2、第三管本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置，其特征在于，包括三通管，所述三通管的三个口分别通过第一管道(1)、第二管道(2)和第三管道(3)连通细胞消化液瓶(4)、分散悬浮液瓶(5)和组织消化瓶(6)；所述组织消化瓶(6)的一侧设有连通内部的出液口(7)，所述出液口(7)通过第五管道(10)连接过滤器(9)的一端，所述过滤器(9)的另一端通过第四管道(8)连通细胞收集瓶(11)；所述第一管道(1)、第二管道(2)、第三管道(3)、第四管道(8)、第五管道(10)上均设有止血钳(12)；所述细胞消化液瓶(4)、分散悬浮液瓶(5)上设有用于通入压空的第一开口(13)和第二开口(14)；所述细胞收集瓶(11)上设有用于抽气的第三开口(15)。2.一种食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离方法，其特征在于，应用如权利要求1所述的食蟹猴胎猴肾脏原代细胞分离装置实现，具体包括以下步骤：S1、获取怀孕150天的食蟹猴胎猴肾脏、清洗、剪碎，转移至组织消化瓶(6)中，并关闭第一管道(1)、第二管道(2)、第三管道(3)、第四管道(8)、第五管道(10)上的止血钳(12)；S2、将组织消化瓶(6)置于带有加热功能的磁力搅拌器上，打开第一管道(1)、第三管道(3)、第四管道(8)、第五管道(10)上的止血钳(12)，将细胞消化液瓶(4)中的细胞消化液打入到组织消化瓶(6)中；S3、...

【专利技术属性】
技术研发人员：靳玮华，和占龙，张伟，李艳艳，杨凤梅，陈丽雄，徐鸿界，李明学，刘权，李咏洁，邓自君，唐洁，张凡邦，孙文亭，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：