急性心梗早期检测标记物及检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开的急性心梗早期检测标记物及检测试剂盒，本发明专利技术设计和实验验证了合适长度的核酸标记物能够在很短的时间内的检测心血管疾病疾病状态下基因心梗和心衰早期发病情况，以此项技术设计的试剂盒可以用于心血管疾病的早期快速诊断，当血管内皮细胞获心肌细胞处于异常血流压力，高血脂蛋白或心肌细胞受损细胞紧张时，通过检测血液中心肌肌钙蛋白的磷酸化情况和心肌细报钙离子通道变化的情况，以及联合检测其他传通的心梗心衰诊断标志物如肌红蛋白通路上分子的变化，可以早期诊断和预测心学管疾病特别是心梗和脑梗的风险。测心学管疾病特别是心梗和脑梗的风险。

【技术实现步骤摘要】
急性心梗早期检测标记物及检测试剂盒


[0001]本专利技术属于生物学检测
，特别涉及急性心梗早期检测标记物及检测试剂盒。

技术介绍

[0002]心梗和心衰生心血管病的主要死亡因素之一，在中国心血管病涉及3亿多人口，平均每个家庭1.5位，每13秒致残1人，28秒致死1人。2015年，我国心血管医药费用高达2930亿。由此可见，心脑血管疾病给人们身体健康和社会经济造成了极大损失。长期以来，心血管疾病占居人口死亡率的第一位，但是对心学疾病的诊断鲜有敏感性和特异性高的生物标记物，对于心梗脑梗更缺少有效的早期诊断方法。
[0003]临床上目前主要检测血浆MPO水平与心血管异常的发生情况如心梗，脑梗和死亡的关系，此外还有肌钙蛋白，肌红蛋白和肌酸激酶(CK)及肌酸激酶同工酶(CK—MB))等等，此类生物标记物主要发生在心肌受损和心学管症状的临床中晚期，对于心血管疾病的早期，目前尚无有效特异的早期心血管疾病的诊断方法和生物标记物。而且，检测的方发还是以酶联免疫标记和免疫发光技术为主，缺乏新颖的基因分子生物学方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术采用目前先进的等温核酸基因扩增技术通过对45例急行心梗心衰基因组外显子测序结果的差异化表达筛选出来的自主开发的新的基因生物标志物，作为急性心梗早期检测标记物，从而为心梗和心衰衰患者提供早期高灵敏度的基因分子诊断，特点为低成本,快速,可在15分钟内做出检测结果。
[0005]本专利技术的主要目的是提供急性心梗早期检测标记物及检测试剂盒，为心血管疾病的早期诊断提供快速特异的新的诊断方法，减少患病人群的死亡。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提出的急性心梗早期检测标记物，其序列为：
[0007][0008]优选地，标记物序列，还包括：
[0009][0010]优选地，急性心梗早期检测试剂盒，包括扩增及上述所述的任一项标记物。
[0011]优选地，所述的标记物为AHNAK基因。
[0012]优选地，所述的AHNAK基因
[0013][0014]优选地，所述的AHNAK基因
[0015][0016]优选地，急性心梗早期检测试剂盒，还包括DNA聚合酶和试剂。其中试剂包括DNA聚合酶，合成的引物，dNTP,缓冲液和纯净水。
[0017]本专利技术设计和实验了该AHNAK基因能够在很短的时间内的检测心血管疾病疾病状态下基因心梗心衰标志物，以此项技术设计的试剂盒可以用于心血管疾病的早期快速诊断，当血管内皮细胞获心肌细胞处于异常血流压力，高血脂蛋白或心肌细胞受损细胞紧张时，通过检测血液中心肌肌钙蛋白的磷酸化情况和心肌细报钙离子通道的情况，以及联合检测其他传通的心梗心衰诊断标志物如肌红蛋白通路上分子的变化，可以早期诊断和预测心学管疾病特别是心梗和脑梗的风险。
具体实施方式
[0018]下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0019]另外，在本专利技术中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本专利技术要求的保护范围之内。
[0020]本专利技术通过第一批45例心梗心衰患者的外周血样本与正常对照人群样本外显子测序，总共发现5个与急性心梗和心衰相关的基因其中1个基因，通过对这这个高表达基因设计核酸基因探针和荧光标记物，来检测这个新的潜在的急性心梗和心衰的基因标志物。
[0021]我们通过对我们用急性心梗和心衰外显子测序实验筛选出来的同时在心梗和心衰方面差异化表达出的AHNAK基因作为全新的心梗和心衰基因，是基于中国人群患者发现的，我们的发现不是基于染色体片段相关，而是基因外显资全序列测序得到的，在转化应用上更具有应用价值，我们设计了序列设计的探针，做为心梗和心衰早期诊断的探索性的方法。
[0022]在血液异常流变的状态下(如高血脂，高甘有三脂)，可以激活XBP
‑
1S 和旁路剪切，导致血管内皮细胞调亡和动脉粥样硬化的发展，根据我们的外显子NGS测序数据分析，
我们已经确定了与急性心肌梗死(AMI)和冠状动脉疾病(CAD)相关的差异表达基因AHNAK。AHNAK与调节心脏中的L型钙通道相关。
[0023]人类的AHNAK是一个位于11号染色体的近20000多个核苷酸的基因，编码128个氨基酸170道顿的蛋白，也在心脏等多器官中高表达。AHNAK蛋白主要参与机体血脑屏障的保护，肿瘤转移，细胞结构与迁移，特别是参与细胞钙离子通道的调节，本课题外显子测序结果表明AHNAK是一个在急性心梗和心衰中显著差异化表达的基因，可以做为中国人群急性心梗和心衰疾病早期诊断的候选基因之一。
[0024]通过对相关等数据库的搜索和分析，我们发现AHNAK有一个转录异体基因AHNAK2，但是这个基因在14号染色体上，可能与心梗心衰无关。我们对 AHNAK的全基因序列做了调去，发现基因很大，其长度达到了18761个核苷酸。根据我们对序列的分析，我们用Primer3软件设计出下列4对核酸探针，用于临床样本测试。
[0025]AHNAK核酸探针序列1
[0026][0027]PRODUCT SIZE:246,PAIR ANY COMPL:4.00,PAIR 3'COMPL:3.00
[0028]AHNAK核酸探针序列2
[0029][0030][0031]PRODUCT SIZE:237,PAIR ANY COMPL:4.00,PAIR 3'COMPL:0.00
[0032]AHNAK核酸扩增检测方法：
[0033]体系1：
[0034][0035]体系2：
[0036][0037]将体系1在70℃水浴5min后，冰浴2min后，与体系2混合，于37℃15min， 42℃60min，70℃10min。
[0038]结果判断：AHNAK基因在我们急性心梗和心衰的45例病人中有显著性差异性高表达。
[0039]上述等温扩增的方法为针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物(包括2条内引物和2条外引物)，利用一种具有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，其反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。其基本原理是靶DNA变性后，内外引物在Bst DNA聚合酶作用下延伸，随后外引物进行延伸，同时其延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA，然后进入循环扩增阶段，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.急性心梗早期检测标记物，其特征在于，其序列为：LEFT PRIMER 176 20 60.38 50.00 7.00 0.00 TGGGTGCCACCATCTACTTTRIGHT PRIMER 421 20 60.12 50.00 4.00 3.00 ATGCTCCAAAGAACGGTCAC2.根据权利要求1所述的急性心梗早期检测标记物，其特征在于：还包括序列：LEFT PRIMER 378 20 60.22 55.00 6.00 3.00 CCACCCCCTCTTAAGGTTGTRIGHT PRIMER 614 20 59.72 60.00 3.00 1.00 CCTAAGCCCACACTCTGTCC3.急性心梗早期检测试剂盒，其特征在于：包括扩增及上述所述任一项的标记物。4.根据权利要求3所述的急性心梗早期检测试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨海涛，廖晓星，梁誉斌，
申请(专利权)人：中山大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：