一种UPLC-MS/MS同时检测牛羊可食性组织中10种同化激素残留的方法技术

本发明专利技术公开了一种UPLC

【技术实现步骤摘要】
一种UPLC
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MS/MS同时检测牛羊可食性组织中10种同化激素残留的方法


[0001]本专利技术涉及同化激素检测
，尤其涉及一种UPLC
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MS/MS同时检测牛羊可食性组织中10种同化激素残留的方法。

技术介绍

[0002]同化激素是一类具有强的蛋白质同化作用，可抑制异化或氧化代谢，提高蛋白质沉积的甾体类物质，具有重要的残留毒理学意义。畜禽养殖业中最普遍的同化激素主要有睾酮、甲基睾酮、黄体酮、群勃龙、勃地龙、诺龙、美雄酮、康力龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙等。目前对于已建立的动物源性同化激素残留检测方法中，应用得最广泛的有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱串联质谱法(GC
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MS)、液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)和酶联免疫法(ELISA)，此外还有高效毛细管电泳法(HPCE)、时间分辨荧光免疫分析(TR
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FIA)和化学发光免疫分析技术(CLIA)等。这里只对HPLC、GC
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MS、LC
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MS/MS和ELISA进行综述。
[0003](1)高效液相色谱法(HPLC)
[0004]HPLC在分析检测中较为普及，其具有高速、高压、高效等特点，一些热稳定性差、强极性的大分子化合物可用HPLC进行分析。在实验室，HPLC常用于样品中单一药物残留检测分析，操作简单，应用范围广。但HPLC法由于灵敏度较低、特异性较差，检测多种激素残留时，需要较长的时间，已经不能满足兽药残留分析中快检和痕量分析的要求。因此，目前常将待测物质经液相色谱仪器进行梯度洗脱后，再通过质谱仪扫描进行药物的分析检测。
[0005]汪竟芝等采用紫外吸收
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高效液相色谱法同时测定鸡蛋中的雌二醇、雌酮、雌三醇及睾酮残留量，样品经甲醇提取，4种激素的方法样品回收率是 79.23％～102.26％，检出限为0.06mg/kg～0.17mg/kg，相对标准偏差为 1.05％～4.21％，方法准确度高，操作简便。王炼等建立了二极管阵列
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高效液相色谱法对肉类食品及牛奶中11种甾体激素的残留检测方法，样品使用乙腈超声提取，酶解并稀释后采用SPE小柱进行富集，11种激素的检出限为0.009～0.020 mg/kg，平均回收率为51.0％～107.0％。张兰等建立了10种蛋白同化激素的同时分离检测的高效液相色谱法，采用C18反相色谱柱，以乙腈和水作为流动相，采用梯度洗脱方式对10种药物进行分离，通过紫外吸收检测器进行分析，待测组分在10min内实现了快速的分离，方法的检出限在0.01～0.10μg/mL范围内，平均回收率为70.3％～120％。
[0006](2)气相色谱串联质谱法(GC
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MS)
[0007]气相色谱串联质谱法的原理是是混合物质通过气相色谱仪进行分离为单个组分，然后进入质谱仪中进行检测。药物在进入GC
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MS分析检测前需要经过繁琐的衍生化处理，该方法仅适用于检测热稳定性好、可挥发、沸点较高的药物，而大多数激素类药物的热稳定性差以及难以挥发，因此GC
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MS不适用于激素类药物的残留分析检测。蒯霞等采用气相色谱串联质谱法检测动物肌肉组织中残留的9种甾类同化激素，样品经过固相萃取净化和衍生化后，经气相色谱串联质谱分析检测，甲睾酮、丙酸睾酮等9种甾类激素的定量限为1.0～2.0μg/kg，平均回收率为62.5％～80.5％，相对标准偏差为12.5％～26.8％，能满足残留检测需
求。
[0008](3)液相色谱
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串联质谱法(LC
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MS/MS)
[0009]LC
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MS/MS是在液相色谱的基础上连接一个或两个质谱分析仪，结合了 HPLC的高分离能力和MS较强的结构鉴定能力的优点。液相色谱将多个化合物进行有效的分离洗脱后，进入到质谱仪中进行电喷雾或大气压化学电离，能够准确定性和定量动物组织、血浆、尿液等复杂基质中的痕量化学物质。相对于液相色谱，激素类药物在LC
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MS/MS法中能得到更低的检测限和定量限，仪器的灵敏度更高。相对于GC
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MS，药物在进入LC
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MS/MS前不需要进行繁琐的衍生化处理，克服了同化激素类药物易在GC
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MS中样品挥发性和热稳定性限制的问题。几年来，随着前处理技术的发展，LC
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MS/MS广泛应用于蛋白同化激素的残留检测分析之中，以监控动物源性食品中同化激素的违禁添加使用。
[0010]贺利民等建立了测定动物肌肉组织和鸡蛋中残留的甾体激素类药物的超高效液相色谱
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串联质谱法，样品基质在碱性条件下用叔丁基甲醚提取，冷冻离心脱脂净化，以乙腈和甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，方法的检测限为0.3～0.4 μg/Kg，回收率大于50％，相对标准偏差小于16％。YouY等用超高效液相色谱
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串联质谱法建立了马血浆中两种雄激素快速测定方法，用甲基叔丁基醚和乙酸乙酯混合溶液(50:50，v/v)对马尿进行液液萃取，在C18色谱柱上进行分离洗脱，并在三联四极质谱仪上用正电喷雾电离模式和选择的反应监测扫描进行检测，两种分析物的检测限为50pg/0.5mL。KaabiaZ等建立了一种能检测血清和血浆中微量(低于50pg/mL)20多种甾体激素的快速分析方法，可用于牛和马的兴奋剂检测。在预处理步骤之后，将样品提交到固相萃取(SPE)中，然后使用UPLC
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MS/MS进行分析。陈君慧建立了牛肉和鸡肉中12种甾体激素的超高效液相色谱
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串联质谱法，并对比了固相萃取法和基质固相萃取法两种不同的基质净化方式下方法的灵敏度、回收率和重现性，优化了传统固相萃取法，研究了基质固相萃取法的最佳条件，固相萃取法的检出限在0.3～1.0μg/L之间，平均回收率在64.75％～112.53％之间，基质固相萃取法检出限在0.2～0.8μg/L之间，平均回收率在72.7％～123.3％之间。高旭东建立了畜禽肉中雄激素及同化激素的高效液相色谱
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串联质谱法，以乙腈
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0.1％甲酸水为流动相梯度洗脱，利用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱对进行分离，采用正离子模式扫描，多反应监测模式(MRM)采集信号，10种目标激素的检出限为1ng/kg，加标回收率为51.06％～91.34％之间，相对标准偏差为0.64％～3.62％，该方法采用QuEChERS技术，相对于传统的前处理技术较为快捷简单。王飞等采用超高压液相色谱
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串联质谱法快速测定牛肉和牛肾中3种甾类同化激素，该方法以叔丁基甲醚为提取溶剂，采用旋蒸后对样品进行低温冷冻后再离心除脂的方法，不经过固相萃取净化，在1.0、2.0、10.0μg/kg 3个添加浓度水平下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种UPLC
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MS/MS同时检测牛羊可食性组织中10种同化激素残留的方法，其特征在于，步骤如下：取样：取牛羊可食性组织，切碎，进行匀浆处理，得组织匀浆液；提取：向可食性肌肉组织匀浆液中加入pH＝5.2的乙酸铵缓冲液，向可食性非肌肉组织匀浆液中加入pH＝5.2的乙酸铵缓冲液和β
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葡萄糖醛苷酶；然后水浴、冷却，再向组织匀浆液中加入乙酸乙酯，涡旋，超声提取，涡旋，离心，取上清液，向沉淀物中加入甲醇的乙腈溶液，重复以上涡旋、超声提取、涡旋、离心步骤，合并上清液，置于
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80℃下冷冻2h备用；然后将冷冻后的上清液冷冻离心，再水浴旋转蒸干，最后加入乙腈溶解残渣，超声溶解，再加水稀释，冷冻离心，取上清液，即为提取液；净化：将提取液上C18固相萃取柱进行净化，先用甲醇、水活化，再将提取液过柱，然后用30vt％甲醇水溶液淋洗，负压抽干，用乙腈洗脱，收集洗脱液；将洗脱液用氮气吹干，采用30vt％乙腈水溶液超声复溶，过0.22μm滤膜后供UPLC分析；测定：采用UPLC
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MS/MS检测；UPLC色谱条件为：色谱柱为Agilent ZORBAX SB
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Aq，2.1mm
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150mm、3.5μm；柱温37℃；流动相A为0.1vt％甲酸的乙腈溶液，流动相B为0.1vt％甲酸的水溶液；梯度洗脱程序为：0.0～1.0min，60vt％A；1.0～3.0min，45vt％A；3～4min，25vt％A；4～8min，0vt％A；8～10.5min，60vt％A...

【专利技术属性】
技术研发人员：方炳虎，叶渭源，
申请(专利权)人：广东温氏大华农生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：