用于基因组工程的组合物和方法技术

本发明专利技术提供推拉式供体构建体及其在基因组工程中的使用方法。组工程中的使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于基因组工程的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求2019年11月1日提交的美国临时申请第62/929,523号的优先权及权益，其内容以全文引用的方式并入本文中。
[0003]序列表
[0004]本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交，其全文以引用的方式并入本文中。2020年10月27日创建的该ASCII拷贝命名为000222
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0009
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WO1_SL.txt，大小为392,177个字节。
现有技术
[0005]已描述了用于基因组DNA的靶向切割的各种方法和组合物。此类靶向切割事件可用于例如诱导靶向诱变、诱导细胞DNA序列的靶向缺失及促进预定染色体基因座处的靶向重组。
[0006]这些方法通常涉及使用工程化切割系统诱导靶DNA序列中的双链断裂(DSB)或缺刻，使得通过诸如非同源末端接合(NHEJ)的错误产生过程修复断裂或使用修复模板(同源性导引的修复或HDR)修复可促成基因敲除或所关注序列的插入(靶向整合)。可经由使用诸如工程化锌指核酸酶(ZFN)、类转录活化因子效应核酸酶(TALEN)的特定核酸酶，使用具有工程化crRNA/tracr RNA(单一向导RNA')的CRISPR/Cas系统导引特定切割和/或使用基于Argonaute系统(例如来自T.thermophilus，被称为“TtAgo”(Swarts等人(2014)Nature507(7491):258
‑
261))的核酸酶进行切割。
[0007]可利用使用上文所提及的核酸酶系统之一的靶向切割来使用HDR或NHEJ介导的过程将核酸插入至特定靶位置中。然而，使用NHEJ将核酸插入至某些细胞类型(例如心肌细胞、中型多棘神经元、原代肝细胞、胚胎干细胞、诱导的多能干细胞及肌肉细胞)中的靶位置处的常规方法并不高效，因为供体核酸需以正确定向插入，导致仅一半整合事件富有成效。
[0008]因此，仍需要更高效的用于所关注细胞的基因组工程的组合物和方法。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供以“推拉式(push
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pull)”定向构造以使治疗性蛋白的表达改善的供体构建体。这些“推拉式”供体构建体能够以高精确度及效率整合至靶基因组中，因此适用于治疗例如个体的遗传病症的方法中，所述方法包含修饰细胞的基因组中的靶核苷酸序列。因此，本专利技术的第一方面提供一种多核苷酸构建体，其在5'至3'方向包含：
[0010]a.第一反向末端重复(ITR)核苷酸序列；
[0011]b.编码第一多肽的第一核苷酸序列；
[0012]c.编码第二多肽的第二核苷酸序列；和
[0013]d.第二ITR核苷酸序列；
[0014]其中编码第一多肽的第一核苷酸序列被定向为与编码第二多肽的第二核苷酸序列尾对尾；且其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列编码具有相同氨基酸序列的
多肽。
[0015]在一些实施方案中，本专利技术的多核苷酸构建体进一步包含：
[0016]第一剪接受体序列，其以可操作方式连接于编码该第一多肽的第一核苷酸序列；和
[0017]第二剪接受体序列，其以可操作方式连接于编码该第二多肽的第二核苷酸序列。
[0018]在一些实施方案中，所述第一剪接受体序列及第二剪接受体序列中的每一个独立地选自因子9剪接受体(F9SA)、CFTR剪接受体、COL5A2剪接受体、NF1剪接受体、MLH1剪接受体及白蛋白(ALB)剪接受体。
[0019]在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体进一步包含：
[0020]g.第一聚腺苷酸化(polyA)信号序列，其以可操作方式连接于编码该第一多肽的核苷酸序列；和
[0021]h.第二聚腺苷酸化(polyA)信号序列，其以可操作方式连接于编码该第二多肽的核苷酸序列。
[0022]在一些实施方案中，所述第一polyA信号序列选自人类生长激素(hGH)polyA信号、牛生长激素(bGH)polyA信号、SV40 polyA信号及rbGlob polyA信号。在一些实施方案中，所述第二polyA信号序列选自人类生长激素(hGH)polyA信号、牛生长激素(bGH)polyA信号、SV40 polyA信号及rbGlob polyA信号。
[0023]在一些实施方案中，编码该第一多肽的核苷酸序列或编码该第二多肽的核苷酸序列编码治疗性多肽。在一些实施方案中，所述治疗性多肽选自由以下组成的组：艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶(IDS)、α
‑
L
‑
艾杜糖醛酸酶(IDUA)、α
‑
D
‑
甘露糖苷酶、N
‑
天冬氨酰基
‑
β
‑
氨基葡萄糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、胱氨酸转运蛋白(cystinosin)、溶酶体相关膜蛋白2、α
‑
半乳糖苷酶A、酸性神经酰胺酶、α岩藻糖苷酶、组织蛋白酶A、酸性β
‑
葡糖脑苷脂酶、β半乳糖苷酶、β氨基己糖苷酶A、β氨基己糖苷酶B、β氨基己糖苷酶、GM2神经节苷脂活化因子、GLcNAc
‑1‑
磷酸转移酶、β
‑
半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶A、乙酰肝素N
‑
硫酸酯酶、α
‑
N
‑
乙酰基氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoA:α
‑
葡萄糖胺乙酰转移酶、N
‑
乙酰基葡萄糖胺
‑6‑
硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、β
‑
葡萄糖醛酸酶、透明质酸酶、神经氨酸酶、黏脂蛋白
‑
1、甲酰基甘氨酸生成酶、棕榈酰基蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、CLN3蛋白、半胱氨酸串蛋白α、CLN5蛋白、CLN6蛋白、CLN7蛋白、CLN8蛋白、酸性鞘磷脂酶、NPC 1、NPC 2、苯丙氨酸羟化酶、酸性α
‑
葡萄糖苷酶、组织蛋白酶K、唾液酸转运蛋白(sialin)、α
‑
N
‑
乙酰氨基半乳糖苷酶、葡萄糖
‑6‑
磷酸酶、溶质载体家族37成员4、精氨基琥珀酸合酶1、溶质载体家族25成员13及鸟氨酸氨甲酰基转移酶。
[0024]在一些实施方案中，编码该第一多肽的核苷酸序列经密码子多样化。在一些实施方案中，编码该第二多肽的核苷酸序列经密码子多样化。在一些实施方案中，编码该第一多肽的核苷酸序列和编码该第二多肽的核苷酸序列中的每一个各自独立地经密码子多样化。
[0025]在一些实施方案中，编码该第一多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:184
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193中任一所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码该第二多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:184
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193中任一所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸构建体包含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多核苷酸构建体，其在5'至3'方向包含：a)第一反向末端重复(ITR)核苷酸序列；b)编码第一多肽的第一核苷酸序列；c)编码第二多肽的第二核苷酸序列；和d)第二ITR核苷酸序列；其中编码第一多肽的第一核苷酸序列被定向为与编码第二多肽的第二核苷酸序列尾对尾；且其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列编码具有相同氨基酸序列的多肽。2.根据权利要求1所述的多核苷酸构建体，其进一步包含：e.第一剪接受体序列，其以可操作方式连接于编码该第一多肽的第一核苷酸序列；和f.第二剪接受体序列，其以可操作方式连接于编码该第二多肽的第二核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的多核苷酸构建体，其中所述第一剪接受体序列及第二剪接受体序列中的每一个是独立地选自因子9剪接受体(F9SA)、CFTR剪接受体、COL5A2剪接受体、NF1剪接受体、MLH1剪接受体及白蛋白(ALB)剪接受体。4.根据权利要求1或2所述的多核苷酸构建体，其进一步包含：g.第一聚腺苷酸化(polyA)信号序列，其以可操作方式连接于编码该第一多肽的核苷酸序列；和h.第二聚腺苷酸化(polyA)信号序列，其以可操作方式连接于编码该第二多肽的核苷酸序列。5.根据权利要求4所述的多核苷酸构建体，其中所述第一polyA信号序列选自人类生长激素(hGH)polyA信号、牛生长激素(bGH)polyA信号、SV40 polyA信号及rbGlob polyA信号。6.根据权利要求4或5所述的多核苷酸构建体，其中所述第二polyA信号序列选自人类生长激素(hGH)polyA信号、牛生长激素(bGH)polyA信号、SV40 polyA信号及rbGlob polyA信号。7.根据权利要求1至6中任一项所述的多核苷酸构建体，其中编码该第一多肽的核苷酸序列或编码该第二多肽的核苷酸序列编码治疗性多肽。8.根据权利要求7所述的多核苷酸构建体，其中所述治疗性多肽选自由以下组成的组：艾杜糖醛酸
‑2‑
硫酸酯酶(IDS)、α
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L
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艾杜糖醛酸酶(IDUA)、α
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D
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甘露糖苷酶、N
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天冬氨酰基
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β
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氨基葡萄糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、胱氨酸转运蛋白、溶酶体相关膜蛋白2、α
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半乳糖苷酶A、酸性神经酰胺酶、α岩藻糖苷酶、组织蛋白酶A、酸性β
‑
葡糖脑苷脂酶、β半乳糖苷酶、β氨基己糖苷酶A、β氨基己糖苷酶B、β氨基己糖苷酶、GM2神经节苷脂活化因子、GLcNAc
‑1‑
磷酸转移酶、β
‑
半乳糖神经酰胺酶、芳基硫酸酯酶A、乙酰肝素N
‑
硫酸酯酶、α
‑
N
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乙酰基氨基葡萄糖苷酶、乙酰CoA:α
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葡萄糖胺乙酰转移酶、N
‑
乙酰基葡糖胺
‑6‑
硫酸酯酶、芳基硫酸酯酶B、β
‑
葡萄糖醛酸酶、透明质酸酶、神经氨酸酶、黏脂蛋白
‑
1、甲酰基甘氨酸生成酶、棕榈酰基蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、CLN3蛋白、半胱氨酸串蛋白α、CLN5蛋白、CLN6蛋白、CLN7蛋白、CLN8蛋白、酸性鞘磷脂酶、NPC 1、NPC2、苯丙氨酸羟化酶、酸性α
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葡萄糖苷酶、组织蛋白酶K、唾液酸转运蛋白、α
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N
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乙酰氨基半乳糖苷酶、葡萄糖
‑6‑
磷酸酶、溶质载体家族37成员4、精氨基琥珀酸合酶1、溶质载体家族25成员13及鸟氨酸氨甲酰基转移酶。9.根据权利要求1至8中任一项所述的多核苷酸构建体，其中编码该第一多肽的核苷酸
序列经密码子多样化。10.根据权利要求1至9中任一项所述的多核苷酸构建体，其中编码该第二多肽的核苷酸序列经密码子多样化。11.根据权利要求1至10中任一项所述的多核苷酸构建体，其中编码该第一多肽的核苷酸序列和编码该第二多肽的核苷酸序列中的每一个各自独立地经密码子多样化。12.根据权利要求1至11中任一项所述的多核苷酸构建体，其中编码该第一多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:184
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193中任一所示的核苷酸序列。13.根据权利要求1至12中任一项所述的多核苷酸构建体，其中编码该第二多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:184
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193中任一所示的核苷酸序列。14.根据权利要求1所述的多核苷酸构建体，其中所述多核苷酸构建体包含SEQ ID NO:173
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176中任一所示的核苷酸序列。15.一种载体，其包含根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体。16.根据权利要求15所述的载体，其中所述载体为腺相关病毒(AAV)载体。17.根据权利要求16所述的载体，其中所述AAV选自由以下组成的组：AAV
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MeCP2、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV8.2、AAV9、双重AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAHrh43、AAVhu37、AAV2/8、AAV2/5及AAV2/6。18.一种细胞，其包含根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体或根据权利要求15至17中任一项的载体。19.根据权利要求18所述的细胞，其中所述细胞为真核细胞。20.根据权利要求19所述的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞。21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞为干细胞。22.根据权利要求19所述的细胞，其中所述细胞为人类细胞。23.根据权利要求18至22中任一项所述的细胞，其中所述细胞为非分裂细胞。24.根据权利要求19至23中任一项所述的细胞，其中所述细胞为肝细胞。25.根据权利要求18至24中任一项所述的细胞，其中所述细胞进一步包含编码核酸酶的多核苷酸。26.根据权利要求18至24中任一项所述的细胞，其中所述细胞进一步包含编码第一锌指核酸酶(ZFN)的第一多核苷酸和编码第二锌指核酸酶(ZFN)的第二多核苷酸。27.根据权利要求18至24中任一项所述的细胞，其中所述细胞进一步包含第一载体及第二载体，所述第一载体包含编码第一锌指核酸酶(ZFN)的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码第二锌指核酸酶(ZFN)的第二多核苷酸。28.根据权利要求18至24中任一项所述的细胞，其中所述细胞进一步包含编码一或多种锌指核酸酶(ZFN)的多核苷酸。29.根据权利要求18至24中任一项所述的细胞，其中所述细胞进一步包含载体，所述载体包含编码一或多种锌指核酸酶(ZFN)的多核苷酸。30.根据权利要求28或29所述的细胞，其中所述锌指核酸酶为二合一锌指核酸酶。31.一种药物组合物，其包含：根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体；和医药学上可接受的运载体。32.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含编码第一锌指核
酸酶(ZFN)的第一多核苷酸和编码第二锌指核酸酶(ZFN)的第二多核苷酸。33.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述组合物包含第一载体及第二载体，所述第一载体包含编码第一锌指核酸酶(ZFN)的第一多核苷酸，所述第二载体包含编码第二锌指核酸酶(ZFN)的第二多核苷酸。34.根据权利要求31所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含编码一或多种锌指核酸酶(ZFN)的多核苷酸。35.根据权利要求32所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含载体，所述载体包含编码一或多种锌指核酸酶(ZFN)的多核苷酸。36.根据权利要求32、34至35所述的药物组合物，其中所述锌指核酸酶为二合一锌指核酸酶。37.根据权利要求32所述的药物组合物，其中编码该第一锌指核酸酶的多核苷酸:编码该第二锌指核酸酶的多核苷酸:根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸的比为1:1:8。38.根据权利要求32所述的药物组合物，其中编码该第一锌指核酸酶的多核苷酸:编码该第二锌指核酸酶的多核苷酸:根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸的比为1:1:4。39.根据权利要求32所述的药物组合物，其中编码该第一锌指核酸酶的多核苷酸:编码该第二锌指核酸酶的多核苷酸:根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸的比为1:1:2。40.根据权利要求32所述的药物组合物，其中编码该第一锌指核酸酶的多核苷酸:编码该第二锌指核酸酶的多核苷酸:根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸的比为3:3:4。41.根据权利要求33所述的药物组合物，其中包含编码该第一锌指核酸酶的第一多核苷酸的载体:包含编码该第二锌指核酸酶的多核苷酸的载体:根据权利要求15至17中任一项的载体的比为1:1:8。42.根据权利要求33所述的药物组合物，其中包含编码该第一锌指核酸酶的第一多核苷酸的载体:包含编码该第二锌指核酸酶的多核苷酸的载体:根据权利要求15至17中任一项的载体的比为1:1:4。43.根据权利要求33所述的药物组合物，其中包含编码该第一锌指核酸酶的第一多核苷酸的载体:包含编码该第二锌指核酸酶的多核苷酸的载体:根据权利要求15至17中任一项的载体的比为1:1:2。44.根据权利要求33所述的药物组合物，其中包含编码该第一锌指核酸酶的第一多核苷酸的载体:包含编码该第二锌指核酸酶的多核苷酸的载体:根据权利要求15至17中任一项的载体的比为3:3:4。45.根据权利要求36所述的药物组合物，其中编码该二合一锌指核酸酶的多核苷酸:根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体的比为1:4。46.根据权利要求36所述的药物组合物，其中编码该二合一锌指核酸酶的多核苷酸:根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体的比为1:2。47.根据权利要求36所述的药物组合物，其中编码该二合一锌指核酸酶的多核苷酸:根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体的比为1:1。48.根据权利要求36所述的药物组合物，其中编码该二合一锌指核酸酶的多核苷酸:根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体的比为3:2。49.根据权利要求33所述的药物组合物，其中包含该二合一锌指核酸酶的载体:根据权
利要求15至17中任一项的载体的比为1:4。50.根据权利要求33所述的药物组合物，其中包含该二合一锌指核酸酶的载体:根据权利要求15至17中任一项的载体的比为1:2。51.根据权利要求33所述的药物组合物，其中包含该二合一锌指核酸酶的载体:根据权利要求15至17中任一项的载体的比为1:1。52.根据权利要求33所述的药物组合物，其中包含该二合一锌指核酸酶的载体:根据权利要求15至17中任一项的载体的比为3:2。53.根据权利要求31至52中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物经调配用于静脉内、肌肉内、皮下或鞘内施用。54.一种修饰细胞的基因组的方法，所述方法包含将有效量的根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体引入至细胞中。55.一种修饰细胞的基因组的方法，所述方法包含将有效量的根据权利要求15至17中任一项的载体引入至细胞中。56.一种修饰细胞的基因组的方法，所述方法包含将有效量的根据权利要求31至53中任一项的药物组合物引入至细胞中。57.一种将外源性核苷酸序列整合至细胞的靶核苷酸序列中的方法，所述方法包含将有效量的根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体引入至细胞中。58.一种将外源性核苷酸序列整合至细胞的靶核苷酸序列中的方法，所述方法包含将有效量的根据权利要求15至17中任一项的载体引入至细胞中。59.一种将外源性核苷酸序列整合至细胞的靶核苷酸序列中的方法，所述方法包含将有效量的根据权利要求31至53中任一项的药物组合物引入至细胞中。60.一种破坏细胞中的靶核苷酸序列的方法，所述方法包含将有效量的根据权利要求1至14中任一项的多核苷酸构建体引入至细胞中。61.一种破坏细胞中的靶核苷酸序列的方法，所述方法包含将有效量的根据权利要求15至17中任一项的载体引入至细胞中。62.一种破坏细胞中的靶核苷酸序列的方法，所述方法包含将有效量的根据权利要求31至53中任一项的药物组合物引入至细胞中...

【专利技术属性】
技术研发人员：I，
申请(专利权)人：美商圣加莫治疗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：