刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法技术

本发明专利技术涉及一种刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法，属于生物技术检测技术领域。本发明专利技术提供了两条刁海龙独有的特征多肽，所述特征多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术提供的特征多肽针对刁海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于刁海龙的鉴别，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法


[0001]本专利技术涉及生物技术检测
，具体涉及两条刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法。

技术介绍

[0002]海龙是我国重要的动物药材，具有温肾壮阳、散结消肿的功效，用药历史悠久，基原众多。中国药典中规定海龙药用基源为海龙科动物刁海龙Solenognathus hardwickii(Gray)、拟海龙Syngnathoides biaculeatus(Bloch)或尖海龙Syngnathusa cusLinnaeus的干燥体。
[0003]目前市场上海龙品种混乱且价格不等，其中刁海龙价格最高，刁海龙除作为原药材制成中成药外，还多以药酒的形式作为保健品使用。由于目前海龙未能有效的实现人工养殖，海龙野生资源日益减少，市场情况日趋复杂，且因刁海龙价格昂贵，多有以其他品种混淆或以次充好。
[0004]目前海龙的种类鉴别和质量控制方法主要有性状鉴定法、HPLC指纹图谱法和分子生物学法。性状鉴定法一般要求海龙个体完整，且需要鉴定者具有丰富的经验，该方法存在一定的主观性；HPLC指纹图谱法专属性较低；分子生物学法具有高专属性，但受限于样品中遗传物质保存的完好程度，对于海龙药酒、炮制品、提取物、虫蛀霉变以及多个个体混杂的样品，因提取DNA困难而无法顺利实验。近年来，越来越多的方法和标准中使用特征肽段对天然药物进行鉴别或定量研究。各物种中所含的蛋白质存在个别位点氨基酸的差别，可用适当的蛋白酶将差异位点截取出来，作为具有标识意义的多肽段，即特征肽段。特征肽段的检测一般使用质谱手段，无需考虑蛋白质活性，制备方法简单且肽段性质较为稳定。现有的海龙鉴定的方法限制因素较多，无法在海龙粉末、海龙药酒、炮制品、提取物等衍生制品中进行应用，海龙蛋白中的特征肽段，有潜力作为海龙物种鉴定的指标成分。目前，各数据库中均未收载刁海龙相关蛋白序列信息，无法通过蛋白序列比对获得差异肽段，因此尚未有刁海龙特征多肽的相关记载。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供两条刁海龙特征多肽及其应用和鉴别刁海龙的方法。本专利技术提供的特征多肽针对刁海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于海龙药材种属鉴别，具体为刁海龙的鉴别，具有良好的应用前景。
[0006]本专利技术提供了两条刁海龙特征多肽，所述特征多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术还提供了上述技术方案所述特征多肽在鉴别刁海龙中的应用。
[0008]进一步的，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2单独或共同在鉴别刁海龙中的应用。
[0009]优选的是，所述鉴别使用质谱法进行，检测离子对包括：SEQ ID NO.1质荷比为m/z 526.7
→
811.4的定量离子，质荷比为m/z 526.7
→
527.3的定性离子；SEQ ID NO.2质荷比为
m/z 690.3
→
856.5的定量离子，质荷比为m/z690.3
→
1052.6的定性离子。
[0010]本专利技术还提供了一种刁海龙的鉴别方法，采用SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的特征多肽作为对照品。
[0011]本专利技术还提供了一种基于上述技术方案所述的特征多肽鉴别刁海龙的方法，包括以下步骤：
[0012](1)供试品溶液的制备：将预处理的海龙提取液或预处理的海龙药酒提取液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液；
[0013](2)对照品溶液的制备：以上述技术方案所述刁海龙特征肽为对照品，加水溶解，得到对照品溶液；
[0014](3)检测分析：利用三重四极杆质谱法进行检测分析；
[0015]所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。
[0016]优选的是，步骤(1)中，所述预处理的海龙提取液的制备方法包括以下步骤：将海龙粉碎，与水混合后煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，使用碳酸氢铵水溶液进行稀释，得到预处理的海龙提取液；
[0017]所述预处理的海龙药酒提取液的制备过程包括以下步骤：将海龙药酒中海龙取出，低温干燥，用水煎煮三次，煎煮时间分别为4h、3h和2h，合并煎煮液，过滤，取滤液，得到预处理的海龙药酒提取液；
[0018]优选的是，所述胰蛋白酶以胰蛋白酶水溶液的形式进行添加，所述胰蛋白酶在所述胰蛋白酶水溶液中的质量浓度为1mg/ml。
[0019]优选的是，所述碳酸氢铵水溶液中碳酸氢铵的质量百分含量为1％。
[0020]优选的是，所述酶解的条件为37℃酶解2h。
[0021]优选的是，所述三重四极杆质谱法以0.1％甲酸乙腈为流动相A，以0.1％甲酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱：0～3min，5％A
→
8％A；流速为每分钟0.5ml。
[0022]优选的是，所述三重四极杆质谱法采用质谱检测器，电喷雾正离子模式，进行多反应监测，SEQ ID NO.1选择质荷比m/z 526.7
→
811.4的定量离子，m/z 526.7
→
527.3的定性离子作为检测离子对，SEQ ID NO.2选择质荷比为m/z 690.3
→
856.5的定量离子，m/z 690.3
→
1052.6的定性离子作为检测离子对。
[0023]本专利技术提供了两条刁海龙特征多肽。本专利技术提供的特征多肽作为刁海龙鉴别的指标成分，可与其他物种的海龙进行区分，为开发刁海龙及相关产品的鉴别方法奠定基础。具体的，本专利技术所述特征多肽具有以下有益效果：
[0024](1)本专利技术通过将蛋白序列中的差异性多肽段截取出来，采用质谱进行检测，操作简单快捷，测定结果稳定，不受海龙样品的形态和加工过程的干扰，填补了刁海龙物种鉴别以及海龙制品中刁海龙检测方法的空白；
[0025](2)本专利技术提供的特征多肽及检测方法，为数据库缺乏的近缘物种中特征肽段的寻找提供了参考；
[0026](3)本专利技术提供的特征多肽针对刁海龙具有优异的专属性和稳定性，特异性强，可用于刁海龙药材的鉴别，具有良好的应用前景。
附图说明
[0027]附图1
‑
9为本专利技术提供的刁海龙特征肽SEQ ID NO.1专属性图谱；
[0028]其中：图1：SEQ ID NO.1特征肽对照；图2：刁海龙样品；图3：拟海龙样品；图4：舒氏海龙样品；图5：多棘刁海龙样品；图6：宝珈枪吻海龙样品；图7：长粗吻海龙样品；图8：粗吻海龙样品；图9：葛氏海镯鱼样品。
[0029]附图10
‑
18为本专利技术提供的刁海龙特征肽SEQ ID NO.2专属性图谱；
[0030]其中：图10：SEQ ID NO.2特征肽对照；图11：刁海龙样品；图12：拟海龙样品；图13：舒氏本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种刁海龙特征多肽，其特征在于，所述特征多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述特征多肽在鉴别刁海龙中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴别使用质谱法进行，SEQ ID NO.1检测离子对包括：质荷比为m/z 526.7
→
811.4的定量离子，质荷比为m/z 526.7
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527.3的定性离子；和/或SEQ ID NO.2检测离子对包括：质荷比为m/z 690.3
→
856.5的定量离子，质荷比为m/z 690.3
→
1052.6的定性离子。4.一种刁海龙的鉴别方法，其特征在于，采用权利要求1所述的特征多肽作为对照品。5.根据权利要求4所述的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：将预处理的海龙提取液或预处理的海龙药酒提取液分别与胰蛋白酶混合，得到混合液，将所述混合液与碳酸氢铵水溶液混合，酶解后过滤，取滤液，得到供试品溶液；(2)对照品溶液的制备：以权利要求1所述刁海龙特征肽为对照品，分别加水溶解，得到对照品溶液；(3)检测分析：利用三重四极杆质谱法进行检测分析；所述步骤(1)或(2)之间没有时间先后顺序的限定。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述预处理的海龙提取液的制备方法包括以下步骤：将海龙粉碎，与水混合后煎煮三次，煎...

【专利技术属性】
技术研发人员：林永强，尹雪，焦阳，汪冰，薛菲，周倩倩，解盈盈，谭乐俊，石丽，
申请(专利权)人：山东省食品药品检验研究院，
类型：发明
国别省市：