一种双功能化蛋白交联剂及其制备和应用制造技术

本发明专利技术的一种双功能化蛋白交联剂及其制备和应用属于交联质谱技术领域，所述双功能化蛋白交联剂是以两个1

【技术实现步骤摘要】
2019,10(1),3911)。同时，专利CN107129455A报道了一种多功能化学交联剂的制备方法，在复杂生物样品中，例如大肠杆菌70S核糖体、大肠杆菌全细胞裂解液以及秀丽隐杆线虫全细胞裂解液都可以鉴定到可观的交联位点，用于后续的测序。尽管有很多交联剂可以交联赖氨酸(Journal of Proteomics 2020,218)、谷氨酸(Analytical Chemistry 2018,90(2),1195
‑
1201；Analytical Chemistry 2018,90(4),2805
‑
2809)、天冬氨酸和半胱氨酸(Acs Applied Materials&Interfaces 2016,8(36),23463
‑
23476；Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2019,30(1),139
‑
148)，因为极性的原因，赖氨酸丰富位于蛋白质的表面，使得高反应活性交联酪氨酸的NHS酯等应用型交联剂受到XL
‑
MS的广泛关注，但是，NHS酯半衰期时间很短，交联反应时间却很长，且在水中易水解，因此有必要开发选择性靶向其他利用率要低的氨基酸的交联剂。甲状腺中通过酪氨酸对的碘化和偶联，并通过甲状腺球蛋白(Thyroglobulin、TG)水解完成甲状腺激素合成(Nature 2020,578(7796),627
‑
630)，TG激素位点的酪氨酸足够接近并暴露，才允许TG合成，酪氨酸的邻近性、灵活性和溶剂暴露是激素生成位点的关键特征，酪氨酸对受到其刚性α
‑
螺旋主链的限制，有些偶联反应不能有效发生。Rh2(AcO)4(AcO
‑
＝CH3COO
‑
)与组氨酸的配位是评估其作为潜在抗癌剂的功效的因素(Journal of Inorganic Biochemistry 2021,224)，得知组氨酸的咪唑环基团在Rh2(AcO)4(L
‑
HHis)2·
2H2O中是轴向配位有助于对这种潜在抗癌剂的后续了解和应用。选择性地靶向交联蛋白质中的酪氨酸残基和组氨酸残基并且确定其三维构型是非常有应用意义的。基于电点击化学原理，可以成功地实现蛋白质中酪氨酸的标记(Journal of the American Chemical Society,2018,140,17120)。在1O2存在的条件下选择性标记蛋白质和多肽中的组氨酸(H)(Journal of the American Chemical Society 2021,143(20),7726
‑
7731)。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，基于点击电化学标记酪氨酸和1O2存在的条件下选择性标记组氨酸的可行性，设计、合成一种新颖且简单的双功能交联剂4,4'
‑
(二硫代二基双(乙烷
‑
2,1
‑
二基))双(1
‑
甲基
‑
1,2,4
‑
三唑烷
‑
3,5
‑
二酮)，简称为DBMT，来促进酪氨酸和组氨酸的鉴定。具有交联很少被报道的酪氨酸和组氨酸的双功能化交联剂第一次被设计合成并应用于交联质谱技术分析(XL
‑
MS)，这势必会丰富并提升XL
‑
MS探究蛋白质、蛋白质复合物的结构和相互作用甚至蛋白质动力学的应用。
[0006]本专利技术的具体的技术方案如下：
[0007]一种双功能化蛋白交联剂，其特征在于，是以两个1
‑
甲基脲唑基团和一个电化学可还原裂解S
‑
S键为骨架结构的双功能化化学交联剂—4,4'
‑
(二硫代二基双(乙烷
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2,1
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二基))双(1
‑
甲基
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1,2,4
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三唑烷
‑
3,5
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二酮)，记为DBMT，结构式为：
[0008][0009]一种双功能化蛋白交联剂的制备方法，有以下步骤：
[0010]步骤一：化合物2的合成
[0011]在惰性气氛下，在反应瓶中，将三乙胺加入到硫酸甲基肼和无水DCM的混合物中,室温下搅拌20min,三乙胺用来中和硫酸甲基肼中的硫酸，随后，将中和后的混合物转移到
‑
60℃冷却浴中，将氯甲酸乙酯缓慢加入到混合物中，撤走冷却浴，室温下反应11h，所得混合物用水萃取一次，用稀NaHCO3萃取两次，将有机层干燥，蒸发溶剂，得到化合物2；按摩尔比，三乙胺:硫酸甲基肼:氯甲酸乙酯＝4:1.3:1；
[0012]步骤二：化合物3的合成
[0013]在惰性气氛下，将碳酸二苯酯加入到耐压管中在80℃熔化，随后加入步骤一制备的化合物2反应3h，通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到化合物3；按摩尔比，碳酸二苯酯:化合物2＝1:2；
[0014]步骤三：化合物4的合成
[0015]将三乙胺加入到胱胺二盐酸盐的无水CH3OH溶液中，室温下搅拌10min，在惰性气氛下，将步骤二制备的化合物3在耐压管中加热至80℃，随后将三乙胺和胱胺二盐酸盐的无水CH3OH溶液加入到耐压管中，反应3h，通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到化合物4；按摩尔比，三乙胺:胱胺二盐酸盐:化合物3＝3:1:2；
[0016]步骤四：DBMT的合成
[0017]在惰性气氛下，在圆底烧瓶中，将步骤三制备的化合物4添加到KOH的无水乙醇的溶液中，将混合物78℃回流12h，将反应混合物冷却至室温并用HCl溶液酸化至pH为2，除去溶剂并将固体用甲醇重新溶解，滤出沉淀，将溶液真空浓缩，得到所述双功能化蛋白交联剂；按摩尔比，化合物4:KOH＝1:5。
[0018]一种双功能化蛋白交联剂的应用，其特征在于，是用于构建蛋白质三维结构，1
‑
甲基脲唑基团在“电点击化学”条件下与酪氨酸特异性交联，在“光反应化学”条件下与组氨酸特异性交联，使用上述化学交联剂DBMT与蛋白质通过“电点击化学”和“光反应化学”的方式进行化学交联反应，将交联的蛋白酶解产物进行质谱鉴定，初步判断蛋白中被修饰的肽段，在源内CID作用下，交联肽段进一步产生特征碎片离子，根据交联肽段的MS2碎裂质谱图确定蛋白质中的交联位点，同时，通过电化学还原的方式，使得交联产物中S
‑
S键发生优先碎裂，具体步骤为：
[0019](1)化学交联反应：首先，进行电化学交联酪氨酸反应，将待鉴定的蛋白质和DBMT溶解于100mM的pH为7.40的PB缓冲液，在0.63V的电压下室温反应4h，反应使用三电极系统为石墨工作电极、铂对电极和饱和甘汞参比电极；其次，进行光反应化学交联组氨酸反应，将电化学交联产物更换缓冲液为pH为7.40，浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双功能化蛋白交联剂，其特征在于，是以两个1
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甲基脲唑基团和一个电化学可还原裂解S
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S键为骨架结构的双功能化化学交联剂4,4'
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(二硫代二基双(乙烷
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2,1
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二基))双(1
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甲基
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1,2,4
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三唑烷
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3,5
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二酮)，记为DBMT，结构式为：2.一种权利要求1所述的双功能化蛋白交联剂的制备方法，有以下步骤：步骤一：化合物2的合成在惰性气氛下，在反应瓶中，将三乙胺加入到硫酸甲基肼和无水DCM的混合物中,室温下搅拌20min,三乙胺用来中和硫酸甲基肼中的硫酸，随后，将中和后的混合物转移到
‑
60℃冷却浴中，将氯甲酸乙酯缓慢加入到混合物中，撤走冷却浴，室温下反应11h，所得混合物用水萃取一次，用稀NaHCO3萃取两次，将有机层干燥，蒸发溶剂，得到化合物2；按摩尔比，三乙胺:硫酸甲基肼:氯甲酸乙酯＝4:1.3:1；步骤二：化合物3的合成在惰性气氛下，将碳酸二苯酯加入到耐压管中在80℃熔化，随后加入步骤一制备的化合物2反应3h，通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到化合物3；按摩尔比，碳酸二苯酯:化合物2＝1:2；步骤三：化合物4的合成将三乙胺加入到胱胺二盐酸盐的无水CH3OH溶液中，室温下搅拌10min，在惰性气氛下，将步骤二制备的化合物3在耐压管中加热至80℃，随后将三乙胺和胱胺二盐酸盐的无水CH3OH溶液加入到耐压管中，反应3h，通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到化合物4；按摩尔比，三乙胺:胱胺二盐酸盐:化合物3＝3:1:2；步骤四：DBMT的合成在惰性气氛下，在圆底烧瓶中，将步骤三制备的化合物4添加到KOH的无水乙醇的溶液中，将混合物78℃回流12h，将反应混合物冷却至室温并用HCl溶液酸化至pH为2，除去溶剂并将固体用甲醇重新溶解，滤出沉淀，将溶液真空浓缩，得到所述双功能化蛋白交联剂；按摩尔比，化合物4:KOH＝1:5。3.一种权利要求1所述的双功能化蛋白交联剂的应用，其特征在于，用于构建蛋白质三维结构，1
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甲基脲唑基团在“电点击化学”条件下与酪氨酸特异性交联，在“光反应化学”条件下与组氨酸特异性交联，使用上述化学交联剂DBMT与蛋白质通过“电点击化学”和“光...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏忠林，闫启博，曹军刚，寮渭巍，段海峰，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：