一种利用功能互补的真菌-细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用功能互补的真菌

【技术实现步骤摘要】
一种利用功能互补的真菌
‑
细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用功能互补的真菌
‑
细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法。

技术介绍

[0002]乳酸是三大有机酸之一，已广泛应用于酿酒、医药、食品、化妆品、卷烟、制革等领域。此外，乳酸还是一种重要的生物基平台化合物，可作为生产原料制造其他化学品，如聚乳酸、丙烯酸、丙酸、2，3
‑
戊二酮、丙酮酸、丙烯、乳酸酯（绿色环保溶剂）、乳酸盐等，具有广阔的应用前景。
[0003]其工业生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法，前者采用的原料主要为乙醛和氰化氢，经反应制得乳腈后进行H2SO4水解生成乳酸，后者主要以葡萄糖、蔗糖等为基质，用微生物发酵的方法制取乳酸。化学合成法生产成本高、环境污染严重且较难合成单一构型的乳酸，微生物发酵法生产乳酸不仅可以克服上述弊端，还具有如下优势：
①
发酵条件温和、成本较低、过程清洁、效率高；
②
通过选择适宜的菌种和底物，在一定的发酵条件下可得到特定的旋光异构体。因此，微生物发酵产乳酸的研究越来越受到关注。
[0004]在众多产乳酸的微生物中，副干酪乳杆菌是目前最具发展前景的生产菌种之一。但目前微生物发酵法合成乳酸的生产成本偏高，影响了其产业化的进程。采用廉价或废弃的非粮生物质资源替代葡萄糖进行乳酸合成，不仅是对废弃的生物质资源再利用，而且可以有效降低乳酸生产原料成本，对促进乳酸生物发酵法生产具有重要的意义。
[0005]木质纤维素类生物质是继煤炭、石油、天然气等化石能源之后最重要的可应用能源之一，被认为世界第四大能源。随着开采型不可再生资源的日趋枯竭，木质纤维素类生物质原料的资源优势愈发显现。棘孢木霉是可以直接利用木质纤维素为碳源进行生长发酵的丝状真菌。棘孢木霉能够在发酵1~2天内迅速的生长，并分泌大量纤维素酶、半纤维素酶和β
‑
葡萄糖苷酶，可以高效降解未经任何化学或生物处理的玉米芯等木质纤维素类原料，在木质纤维素降解方面有着极高的应用价值。
[0006]混菌发酵是指采用两种或多种微生物的协同作用共同完成某发酵过程的一种新型发酵技术，可通过菌株间的“劳动分工”实现复杂代谢任务。目前对于具有合作关系的菌株筛选和组合还是一个随机的过程，缺乏有效的理论指导，而且对于已经应用的混菌培养体系也不能有效地协调菌株间的关系，使其达到最佳生态水平，发挥最大效应，这严重阻碍了混菌发酵的发展和应用。通过“师法自然”策略，从自然界中筛选可以直接利用木质纤维素合成乳酸的天然菌群，并通过对其中核心功能菌株的筛选，构建跨种属的功能互补混菌发酵体系，有助于提升菌群间的有效合作，提高通过一体化生物加工过程利用木质纤维素类原料直接合成乳酸的合成效率。

技术实现思路

[0007]为了解决传统乳酸发酵方法以粮食或其他淀粉质副产品为原料生产成本过高的问题，本专利技术构建了功能互补的棘孢木霉和副干酪乳杆菌的真菌
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细菌混菌体系，实现了直接利用木质纤维素类原料高效合成乳酸的目标。其中棘孢木霉可以分泌纤维素、半纤维水解酶系，高效地降解木质纤维素类原料；而副干酪乳杆菌不能利用纤维素等多糖类物质，但其可以利用积累的纤维二糖、葡萄糖等为碳源，在缓解纤维二糖等对纤维素水解酶的抑制作用的同时，还可以进行高效的乳酸合成。
[0008]本专利技术所述一种利用功能互补的真菌
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细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法，包括以下步骤：（1）将活化的棘孢木霉接种到含有微晶纤维素的发酵培养基中进行发酵，发酵24
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120 h，得到发酵液；（2）将活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，混菌发酵生产乳酸。
[0009]步骤（1）所述棘孢木霉发酵24
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120 h时将步骤（2）活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，厌氧发酵生产乳酸。
[0010]优选地，步骤（1）所述发酵时间为24
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96 h，更进一步地优选为发酵40小时，将活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，发酵液中有一定量葡萄糖，且纤维素酶和β
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葡萄糖苷酶的活性较高，能够持续降解微晶纤维素为葡萄糖，而副干酪乳杆菌可以利用降解得到的葡萄糖生产乳酸。接种时间过早（24 h），纤维素酶的酶活较低，不利用后续微晶纤维素的降解；接种时间过晚（棘孢木霉发酵72
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120 h），则会导致棘孢木霉培养时间过长，纤维素酶和β
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葡萄糖苷酶分泌量减少，酶系的酶活下降，且部分降解得到的葡萄糖也被棘孢木霉利用，从而减少了乳酸的碳流量，最终导致乳酸产量降低。因此，副干酪乳杆菌的接种时间是混菌发酵生产乳酸极为关键的步骤。
[0011]步骤（1）所述活化的棘孢木霉的接种量为发酵培养基体积的1
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5%；所述含有微晶纤维素的发酵培养基配方为：0.1
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0.5 g/L尿素，1.0
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2.0 g/L (NH4)2SO4，1.0
‑
3.0 g/L KH2PO4，0.1
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0.6 g/L CaCl2，0.1
‑
0.6 g/L MgSO4·
7H2O，0.002
‑
0.008 g/L FeSO4·
7H2O，0.001
‑
0.003 g/L MnSO4·
H2O，0.001
‑
0.003 g/L ZnSO4·
7H2O，0.001
‑
0.003 g/L CoCl2，40
‑
120 g/L微晶纤维素，CaCO
3 5 ~35g/L，溶剂为水，调节pH至5.0
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6.0，121 ℃灭菌20 min；所述发酵条件为：发酵温度28
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35 ℃，发酵时间为24
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120 h，发酵pH为5.0
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6.0，转速0
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120 rpm。
[0012]优选地，所述含有微晶纤维素的发酵培养基中微晶纤维素浓度为80 g/L。
[0013]优选地，步骤（1）所述发酵条件为：发酵温度30 ℃，发酵时间40 h，发酵pH为5.5，转速120 rpm。
[0014]所述棘孢木霉的活化培养基配方为0.1
‑
0.5 g/L尿素，1.0
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2.0 g/L (NH4)2SO4，1.0
‑
3.0 g/L KH2PO4，0.1
‑
0.6 g/L CaCl2，0.1
‑
0.6 g/L MgSO4·
7H2O，0.002
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0.008 g/L FeSO4·
7H2O，0.001
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用功能互补的真菌
‑
细菌混菌体系实现木质纤维素合成乳酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将活化的棘孢木霉接种到含有微晶纤维素的发酵培养基中进行发酵，发酵24
‑
120 h，得到发酵液；（2）将活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）的发酵液中，厌氧发酵生产乳酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述棘孢木霉为棘孢木霉（Trichoderma asperellum）LYS1，步骤（2）所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LYS2。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述棘孢木霉发酵24
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96 h后将步骤（2）活化的副干酪乳杆菌接种到步骤（1）得到的发酵液中，厌氧发酵生产乳酸。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述活化的棘孢木霉的接种量为发酵培养基体积的1
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5%。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述发酵条件为：发酵温度28
‑
35 ℃，发酵pH为5.0
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6.0，转速0
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120 rpm。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述含有微晶纤维素的发酵培养基配方为：0.1
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0.5 g/L尿素，1.0
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2.0 g/L (NH4)2SO4，1.0
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3.0 g/L KH2PO4，0.1
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0.6 g/L CaCl2，0.1
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0.6 g/L MgSO4·
7H2O，0.002
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0.008 g/L FeSO4·
7H2O，0.001
‑
0.003 g/L MnSO4·
H2O，0.001
‑
0.003 g/L ZnSO4·
7H2O，0.001
‑
0.003 g/L CoCl2，40
‑
120 g/L微晶纤维素，CaCO
3 5 ~35g/L，溶剂为水，调节pH至5.0
‑
6.0。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）棘孢木霉活化条件为：取0.5
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1.0 mL棘孢木霉菌液涂覆于PDA培养基中于28
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35 ℃培养72
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120 h；用0.5
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1.0 mL无菌水冲洗PDA固体培养基中的菌落，并接种于活化培养基，于28
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35 ℃活化24
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96 h；棘孢木霉种子活化培养基配方为：0.1
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0.5 g/L尿素，1.0
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2.0 g/L (NH4)2SO4，1.0
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3.0 g/L KH2PO4，0.1
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：蒋羽佳，潘润泽，信丰学，章文明，姜万奎，姜岷，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：