靶向修饰外泌体用于递送药物进行宫内治疗的方法研究技术

本发明专利技术公开了一种经过TAT

【技术实现步骤摘要】
靶向修饰外泌体用于递送药物进行宫内治疗的方法研究
[0001]本专利技术涉及生物医药工程领域，具体涉及通过信号肽TAT修饰外泌体，使其增强穿过胎盘屏障的能力，以此为胎儿疾病的宫内治疗提供天然、无创的药物递送体系。

技术介绍

[0002]血胎屏障是胎盘绒毛组织和子宫血窦之间的屏障，是母体与胎儿进行物质交换的重要场所，除了葡萄糖，氨基酸和少量IgG抗体外，血胎屏障会阻止一些外来化合物进入胚胎，从而保证胚胎的正常发育。而胎盘的屏障作用，在胎儿疾病治疗的过程中，会阻碍多种药物，如多肽、蛋白质、核酸等通过胎盘进入胎儿体内发挥药效，并且如果直接进行宫内给药存在穿透性的问题，严重情况下会影响胎儿的健康，导致早产或流产，因此需要更加安全有效的输送药物的方法进行宫内治疗。
[0003]目前运输核酸药物的载体主要有三种，分别是病毒、聚阳离子聚乙烯亚胺(PEI)基纳米颗粒和脂质体。但是这三种方法都会存在一些不足，包括毒性问题、无特异性、免疫激活、递送效率低。而外泌体是细胞天然分泌的，具有免疫原性低，递送效率高等优点，因而成为目前药物递送系统的不错选择。外泌体直径在30～1000nm之间，无论在生理条件下还是在病理条件下，几乎所有细胞类型都能分无论在泌出外泌体。外泌体可包裹蛋白质、DNA、mRNA以及非编码RNA，可以递送到邻近或远处的组织/细胞中，从而调节受体细胞的基因表达。相关研究表明，外泌体可以作为一种载体工具来运送治疗性siRNA或反义microRNA用于肿瘤治疗，这表明了外泌体可以作为一种疾病治疗工具的潜力。并且通过信号肽对外泌体进行修饰可以增强其对靶组织的特异性，增加其递送药物的能力，减少对的副作用。
[0004]TAT信号肽是备受瞩目的跨膜递送药物的载体之一，它不仅可以自身跨膜进入细胞，还可以介导几十种蛋白以及其他外源药物跨膜递送进入细胞。TAT信号肽是HIV编码的全长86个氨基酸的蛋白质中富含11个氨基酸的精氨酸和赖氨酸的部分，且TAT融合蛋白已被证明能够快速高效地进入培养细胞和注射到小鼠组织中，并且研究报道TAT对蛋白质的修饰能够增强蛋白质对胎盘屏障的穿透作用。本专利技术使用TAT与外泌体膜表面蛋白CD63的细胞外端进行修饰，以增加外泌体对胎盘的穿透作用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是基于以上的问题述求，专利技术一种能够穿透胎盘屏障的药物递送外泌体。通过构建TAT
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CD63
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EGFP质粒元件，在外泌体上表达出TAT融合蛋白，使外泌体成为TAT修饰的外泌体，从而增强外泌体通过血胎屏障的能力，使外泌体能够成为研究癌症治疗递送核酸药物的有力工具，为宫内治疗提供了更安全可靠的方法。
[0006]本专利技术的目的的技术方案：首先利用TAT的十一个氨基酸的序列设计TAT
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CD63
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EGFP基因序列，通过公司合成，然后用引物扩增目的基因TAT
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CD63
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EGFP，将其克隆至质粒PEGFP
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N1
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CD63上，用所构建的质粒PEGFP
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TAT
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CD63
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EGFP转化大肠杆菌DH5α并诱导表达。通过质粒提纯，将获得的质粒转染进293T细胞中36小时后得到修饰的外泌体。
[0007]本专利技术的效果验证：收集修饰的外泌体，同时建立孕鼠模型，待见栓18.5天后，尾
静脉注射TAT改造的外泌体，并对外泌体进行示踪，检测胎鼠组织中修饰外泌体的进入水平。
[0008]本专利技术的有益效果是：1.利用该专利技术可以得出，通过构建TAT
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CD63
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EGFP融合蛋白表达质粒能够有效获得TAT修饰的外泌体。2.利用该专利技术可以得出，TAT修饰的外泌体能够高效穿透胎盘屏障。
附图说明
[0009]图1 PEGFP
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TAT
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CD63
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EGFP质粒构建示意图。
[0010]图2 Western免疫印迹图。
[0011]图3尾静脉注射外泌体，主要分三组，第一组孕鼠不经过任何处理(CTL)；第二组尾静脉注射无修饰的外泌体(CD63
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EGFP)；第三组尾静脉注射经过TAT修饰的外泌体(TAT
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CD63
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EGFP)。三组尾静脉注射外泌体进入胎盘的共聚焦结果。
[0012]图4静脉注射外泌体，三组尾静脉注射外泌体进入胎鼠肝脏的共聚焦结果。
[0013]图5静脉注射外泌体，三组尾静脉注射外泌体进入胎鼠肺部的共聚焦结果。
[0014]图6静脉注射外泌体，三组尾静脉注射外泌体进入胎鼠肾的共聚焦结果。
[0015]图7静脉注射外泌体，三组尾静脉注射外泌体进入胎鼠心脏的共聚焦结果。
[0016]图8静脉注射外泌体，三组尾静脉注射外泌体进入胎鼠脑的共聚焦结果。
[0017]图9静脉注射外泌体，三组尾静脉注射外泌体进入胎鼠脾脏的共聚焦结果。
具体实施方式
[0018]下面通过附图和具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0019]实例1构建PEGFP
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TAT
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CD63
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EGFP。
[0020]设计出TAT
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CD63
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EGFP的碱基序列，通过公司合成，然后设计引物扩增出目的基因，将其克隆至质粒PEGFP
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N1
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CD63，用所构建的质粒转化大肠杆菌DH5α并诱导转化。图1为质粒构建示意图。
[0021]实例2获得TAT修饰的外泌体。
[0022]通过提取细胞和外泌体的蛋白，然后使用Western免疫印迹，将蛋白质转移到膜上，然后利用β
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actin、CD9、CD63三个抗体分别进行蛋白检测。图2表明外泌体被大量TAT修饰。
[0023]实例3尾静脉注射修饰的外泌体，通过共聚焦显微镜观察外泌体是否穿透胎盘屏障到达子代器官中。
[0024]通过质粒提纯试剂盒将所构建的质粒提纯，然后将质粒转染到293T细胞中，转染36小时后收集外泌体，并使用DIL对外泌体进行染色示踪。在孕鼠见栓18.5天时，尾静脉注射收集的外泌体，注射六小时后处死孕鼠。孕鼠和胎鼠组织经过固定、脱水、切片、DAPI染色后，通过荧光共聚焦显微镜观察外泌体的去向。实验分三组：第一组孕鼠不经过任何处理(CTL)；第二组尾静脉注射无修饰的外泌体(CD63
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EGFP)；第三组尾静脉注射经过TAT修饰的外泌体(TAT
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CD63
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EGFP)。
[0025]结果分析：
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.通过信号肽修饰外泌体表面蛋白增强外泌体穿过胎盘屏障的能力，为胎儿疾病的宫内治疗提供一种全新的天然高效的药物递送载体。其特征在于信号肽对外泌体的修饰，增强外泌体穿膜能力。2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所构建的外泌体修饰的方法，包括但不限于TAT信号肽修饰，还包括所有其他具体胎盘穿透能力的信号肽修饰。3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所构建的外泌体修饰的原件，包括但不限于质粒载体，还包括慢病毒，腺病毒，等其他表达载体。4.根据权利要求1的应用，其特征在于，靶向修饰的外泌体获得方式，包括但不限于293T细胞表达，还包括其他所有细胞表达，细菌表达，以及动物的在体表达。5.根据权利要求1的应用，其特征在于，靶向修...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟利，童亚飞，谢萍，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：