一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于微生物发酵技术领域，具体公开了一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用，所述微生物菌剂包括里氏木霉、裂褶菌和汉逊德巴利酵母，且所述微生物菌剂中三种菌的活菌数比为1:1:1～1:4:1，此三种菌均可在厌氧、微好氧条件下生长、发酵和转化乙醇，在功能上协同增效又各有侧重，配合使用提高了生产乙醇的能力；并具体公开了利用所述微生物菌剂采用联合生物加工策略制备生物乙醇的方法，所述方法集成产酶、酶解和液体深层发酵三个过程于一个反应体系中，提高了生产效率，降低了成本；且过程中综合利用了秸秆、紫薯渣和豆粕粉中的营养物质，提高了微生物的增殖速度，降低了周期，进而提高乙醇产量及秸秆乙醇转化率。率。

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于微生物发酵
，具体涉及一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]工业化生产生物乙醇绝大多数是以粮食作物为原料，从长远来看具有规模限制和不可持续性；采用秸秆等含木质纤维素的材料为主要原料的第二代生物乙醇是决定未来大规模替代石油的关键。我国每年约产出秸秆9亿吨，目前秸秆的主要处理方式是直接还田，直接还田易导致耕作困难和烧苗等问题，直接焚烧更是会造成环境的污染，用于发电热值利用率低；而以秸秆为原料制备生物乙醇既能解决农业废弃物的堆积又能降低生产成本。
[0003]秸秆中的木质素大约在10~20%，纤维素约30~40%，半纤维素约15~30%，5~15%的灰分（水稻秸秆中二氧化硅约为灰分的60~75%），10~15%的可溶性浸出物。通常木质素的微生物分解产物为芳香族化合物，纤维素的酶解产物是葡萄糖，半纤维的主要酶解产物为木糖，秸秆中的可利用糖类主要是降解后的葡萄糖和木糖。理论糖含量=纤维素含量/0.9+半纤维素含量/0.88，对于秸秆理论上的糖含量约为50~78%，木糖和葡萄糖的乙醇转化率理论上为51%，所以根据纤维素和半纤维素的含量，秸秆的乙醇理论转化值为25.5~39.8%。
[0004]秸秆酶解糖化前需要进行预处理，降低纤维素结晶度、增加了酶的接触位点、打破木质素和二氧化硅的保护。传统预处理方法中，物理方法能耗大、效果差，化学方法易造成二次污染。其中，联合生物加工策略（consolidated bioprocessing，CBP）集成产酶、酶解和乙醇转化过程，将三个过程结合到由微生物介导的一个反应体系中，因此与其他工艺过程相比较，底物和原料的消耗相对较低，能极大的提高生产效率、降低成本。但是CBP对所用的微生物有较高的要求，相比传统的发酵，微生物应具有更好的底物利用度和较好的产品构型。获取生物乙醇炼制CBP微生物菌株通常通过基因工程技术：一种是改造厌氧型产木质纤维素酶的菌生产乙醇，比如热纤梭菌；另一种是改造产乙醇的菌株分解纤维素，如酿酒酵母和运动发酵单胞菌。利用基因工程构建的微生物技术难度高、且容易退化，环境适应能力较差；采用自然界中已有的菌株报道较少，多数真菌通常被认定为好氧菌，虽然随着研究的不断深入，一些厌氧和兼性厌氧真菌不断的被发现和应用。例如魏亚琴等（CN106834140B一种厌氧真菌及用其发酵小麦秸秆生产乙醇的方法）采用厌氧真菌Piromyces sp .为功能菌株生产乙醇，但该菌为厌氧菌，菌株制备和发酵时需要提供严格的厌氧条件，增加了工业化的难度和成本；李国学等（CN101381680A一种利用秸秆水解物发酵生产乙醇的微生物菌剂及其应用 ）先用硫酸处理秸秆，然后利用康宁木霉（Trichoderma konigii Oudem）、水栖丝孢酵母（Trichosporon aquatile）和克鲁维酵母菌（Saccharomyces kluyveri）为功能菌株生产生物乙醇，虽采用了兼性厌氧菌发酵，但增加了酸水解处理秸秆木质素步骤，只实现了SSF（同步糖化发酵）未真正实现CBP联合生物加工策略。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于，提供一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用，所述微生物菌剂可以通过联合生物加工策略（CBP）集成产酶、酶解和发酵过程于一个体系中，实现对秸秆木质纤维素等的高效降解，提高了生物乙醇的生产效率，降低了生产成本。
[0006]为了实现上述技术效果，本专利技术采用如下技术方案：一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂，包括里氏木霉（Trichodermareesei）、裂褶菌（Schizophyllum commune）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hanseni），且三种菌的活菌数比为1:1:1～1:4:1。
[0007]本专利技术的另一目的在于，提供上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：（1）菌株活化：从
‑
80℃保藏的甘油管中分别取裂褶菌、里氏木霉或汉逊德巴利酵母于PDA平板，25~30℃培养2~7天；（2）种子液制备：取活化后的里氏木霉、裂褶菌、汉逊德巴利酵母分别接种于含PDB培养基的三角瓶或发酵罐中培养；（3）取步骤（2）制得的里氏木霉和裂褶菌菌丝球，分别置于匀浆机中制备里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液；（4）按比例分别取里氏木霉菌丝体悬液、裂褶菌菌丝体悬液和汉逊德巴利酵母的种子液混合得所述微生物菌剂。
[0008]优选地，步骤（2）中制得的汉逊德巴利酵母种子液中的活菌数大于3
×
107cfu/ml。
[0009]优选地，步骤（3）中匀浆机的转速为10000r/min，处理时间为5~10s。
[0010]优选地，步骤（3）中里氏木霉和裂褶菌菌丝体悬液中的活菌数大于1
×
107cfu/ml。
[0011]本专利技术的第三目的在于，提供上微生物菌剂制备生物乙醇的应用，具体为：将上述微生物菌剂接入含CBP培养基的三角瓶中，置于恒温摇床中进行培养；具体包括三个阶段：（1）好氧阶段：设置恒温摇床180~220r/min，初始温度28~30℃，发酵时间24~48h；（2）微好氧阶段：摇瓶上部加四层报纸封口，设置恒温摇床转速为50~70r/min，温度为25~28℃，发酵时间2~4d；（3）厌氧阶段：设置恒温摇床转速0r/min，32~34℃，培养至乙醇含量不再增加，停止发酵。
[0012]具体地，所述微生物菌剂的接种量为0.5%~1.5%。
[0013]优选地，所述CBP培养基包括秸秆粉50~70g/L、紫薯渣粉5~15g/L、豆粕粉2~5g/L、碳酸钠4~6g/L和水，将各成分加水混匀并定容后，于120℃灭菌30min，降温后用磷酸调pH至6.0~6.5。
[0014]优选地，所述秸秆粉、紫薯渣、豆粕粉的粒度均为60~100目。
[0015]其中，所述紫薯渣为紫薯提取过色素和淀粉后剩余的产物，约含淀粉17~23%，半纤维素5~15%，纤维素25~40%，剩余为水分和其他如蛋白质、氨基酸及矿物质等，其含有的淀粉可被微生物分解为葡萄糖，为微生物的快速增殖提供速效碳源，另外其他营养物质可与秸秆互补，提高微生物的增殖速度，减少发酵周期。
[0016]上述发酵过程中，好氧阶段为菌体增殖和产酶阶段；主要是里氏木霉分泌淀粉酶和蛋白酶将豆粕粉和紫薯渣里的淀粉和纤维素等水解，里氏木霉、裂褶菌和汉逊德巴利酵
母分泌纤维素酶分解纤维素和半纤维素等，分解产物促进三种菌的生长，此阶段选用温度为里氏木霉产酶最佳温度。
[0017]微好氧阶段为产酶和生物乙醇合成阶段；随着溶氧下降，菌体繁殖变慢，转为代谢途径开始产生乙醇，此时淀粉耗尽，里氏木霉为主分泌大量的纤维素酶；裂褶菌主要分泌漆酶等分解木质素；汉逊德巴利酵母利用分解的己糖和戊糖迅速合成乙醇，减少产物对酶的抑制作用；此阶段的温度为裂褶菌生长产酶最佳温度。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂，其特征在于，包括里氏木霉、裂褶菌、汉逊德巴利酵母，且三种菌的活菌数比为1:1:1～1:4:1。2.权利要求1所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）菌株活化：从
‑
80℃保藏的甘油管中分别取里氏木霉、裂褶菌、汉逊德巴利酵母接种于PDA平板中培养；（2）种子液制备：取活化后的里氏木霉、裂褶菌、汉逊德巴利酵母分别接种于含PDB培养基的三角瓶或发酵罐中培养；（3）取步骤（2）制得的里氏木霉和裂褶菌菌丝球，分别置于匀浆机中制备里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液；（4）按比例分别取里氏木霉菌丝体悬液、裂褶菌菌丝体悬液和汉逊德巴利酵母的种子液混合得所述微生物菌剂。3.根据权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中制得的汉逊德巴利酵母种子液中的活菌数大于3
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107cfu/ml。4.根据权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中匀浆机的转速为10000r/min，处理时间为5~10s。5.根据权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液中的活菌数均大于1
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【专利技术属性】
技术研发人员：王洪凤，杨晴，王庆彬，张晓英，史磊，王宁宁，朱云鹏，陈大印，王珊珊，
申请(专利权)人：山东蓬勃生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：