一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法技术

本发明专利技术涉及干细胞培养技术领域，且公开了一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下步骤制备而成：称取体积份间充质干细胞无血清培养基100份、营养添加物10

【技术实现步骤摘要】
一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，具体为一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法。

技术介绍

[0002]人脐带间充质干细胞是指从脐带中分离的一种多功能干细胞，来源于新生儿脐带中的华通氏胶，具有含量丰富、细胞纯净、免疫原性低的特点，且人脐带间充质干细胞是一种原始细胞，具有很强的分化能力，能分化成许多种组织细胞，同时取材容易、易收集和冷冻保存，具有广阔的临床应用前景和研究价值。
[0003]人脐带间充质干细胞在临床上已经广泛应用，但是受到冻存条件的限值，不能大规模的应用，细胞冻存是细胞长期保存的一种重要手段，细胞冻存液通过冷冻保护剂在冻存过程中对细胞进行保护，减少冷冻冰晶对细胞造成的损伤，现有技术中的细胞冻存多采用血清进行冻存，血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长所需要的营养成分、生长因子和微量元素，能够支持细胞的生长和增殖，同时含有的蛋白能够对细胞起到一定的保护作用，但血清中含有各种不明确的动物源性物质，成分复杂，差异性较大，会对细胞分化造成很大的干扰，还可能引起病原体的交叉感染，影响细胞生长，甚至导致细胞死亡，因此开发出无血清的人脐带间充质干细胞冻存液具有非常重要的研究价值和实际意义。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，避免了含有血清的人脐带间充质干细胞冻存液在临床使用过程中可能存在的风险，解决了常规血清冻存液对细胞分化产生的干扰和病原体污染。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下步骤制备而成：
[0006]步骤一、制备原料：按照体积份计，在生物安全柜中称取间充质干细胞无血清培养基100份、营养添加物10
‑
30份、非渗透性冷冻保护剂4
‑
10份、渗透性冷冻保护剂1
‑
3份；
[0007]步骤二、混合：将步骤一中称取的原料依次加入到无菌试剂瓶中，在生物安全柜中，搅拌混合均匀，得到混合液；
[0008]步骤三、过滤除菌：将步骤二中的混合液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌，转移到新的无菌试剂瓶中，并对无菌试剂瓶中的混合液进行微生物、支原体检测，为阴性合格后备用；
[0009]步骤四、存储：对步骤三中装有检测合格混合液的无菌试剂瓶进行密封处理，冷藏存储。
[0010]作为本专利技术进一步的方案：所述步骤一中非渗透性冷冻保护剂包括羟乙基淀粉、海藻糖、蔗糖、羧甲基纤维素钠中的一种或几种。
[0011]作为本专利技术进一步的方案：所述步骤一中渗透性冷冻保护剂包括甘油、乙二醇中的一种或两种。
[0012]作为本专利技术进一步的方案：所述步骤一中营养添加物包括氨基酸、维生素，其中氨基酸和维生素的体积比为10:2
‑
5。
[0013]作为本专利技术进一步的方案：所述氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸中的一种或几种。
[0014]作为本专利技术进一步的方案：所述维生素包括维生素C、维生素B6、维生素B12中的一种或几种。
[0015]作为本专利技术进一步的方案：所述冷藏存储的温度为2
‑
8℃。
[0016]作为本专利技术进一步的方案：所述的人脐带间充质干细胞无血清冻存液在人脐带间充质干细胞冻存中的应用。
[0017]作为本专利技术进一步的方案：所述人脐带间充质干细胞无血清冻存液应用在人脐带间充质干细胞冻存中，包括以下步骤：
[0018]准备冻存的人脐带间充质干细胞，使用PBS缓冲液清洗，加入胰酶消化后至人脐带间充质干细胞脱落85％以上加入制备得到的人脐带间充质干细胞无血清冻存液终止消化，离心处理，去除上清液，在
‑
80℃保存过夜，转入液氮环境中长期冻存，温度为
‑
196℃。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0020]本专利技术中使用间充质干细胞无血清培养基，不含有动物血清和其它异源性蛋白，减少了人脐带间充质干细胞被污染的可能，同时不使用二甲基亚砜，避免了在临床上潜在的毒性风险，在无血清培养基中加入了特定的营养添加物，提高了人脐带间充质干细胞扩增的效率，并且保持了人脐带间充质干细胞的生物特性，增加了人脐带间充质干细胞的存活率，有效确保了细胞的分化能力。
[0021]本专利技术制备得到的人脐带间充质干细胞无血清冻存液能够更好的维持人脐带干细胞的生物学功能，可直接冻存，不需程序化冻存，操作简单，且冻存效果好，在人脐带间充质干细胞冻存复苏后，仍保有相当高的活性以及优异的分化能力，在临床使用时，也可作为辅料直接使用，具有使用方便的特点。
[0022]当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
[0023]图1为使用不同冻存液的人脐带间充质干细胞复苏后培养的生长曲线对比图。
具体实施方式
[0024]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0025]实施例1
[0026]一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下步骤制备而成：
[0027]按照体积份计，在生物安全柜中称取间充质干细胞无血清培养基100份、营养添加
物缬氨酸10份、维生素C为2份、非渗透性冷冻保护剂羟乙基淀粉4份、渗透性冷冻保护剂甘油1份；将称取的原料依次加入到无菌试剂瓶中，在生物安全柜中，搅拌混合均匀，得到混合液；将得到的混合液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌，转移到新的无菌试剂瓶中，并对无菌试剂瓶中的混合液进行微生物、支原体检测，检验合格后，对无菌试剂瓶进行密封处理，在2℃冷藏存储。
[0028]实施例2
[0029]一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下步骤制备而成：
[0030]按照体积份计，在生物安全柜中称取间充质干细胞无血清培养基100份、营养添加物缬氨酸10份、谷氨酸4份、维生素C为2份、维生素B6为3份、非渗透性冷冻保护剂羟乙基淀粉4份、蔗糖2份、渗透性冷冻保护剂甘油1份、乙二醇1份；将称取的原料依次加入到无菌试剂瓶中，在生物安全柜中，搅拌混合均匀，得到混合液；将得到的混合液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌，转移到新的无菌试剂瓶中，并对无菌试剂瓶中的混合液进行微生物、支原体检测，检验合格后，对无菌试剂瓶进行密封处理，在4℃冷藏存储。
[0031]实施例3
[0032]一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下步骤制备而成：
[0033]按照体积份计，在生物安全柜中称取间充质干细胞无血清培养基10本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤制备而成：步骤一、制备原料：按照体积份计，称取间充质干细胞无血清培养基100份、营养添加物10
‑
30份、非渗透性冷冻保护剂4
‑
10份、渗透性冷冻保护剂1
‑
3份；步骤二、混合：将步骤一中称取的原料依次加入到无菌试剂瓶中，搅拌混合均匀，得到混合液；步骤三、过滤除菌：将步骤二中的混合液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌，转移到新的无菌试剂瓶中，并对无菌试剂瓶中的混合液进行微生物、支原体检测，为阴性合格后备用；步骤四、存储：对步骤三中装有检测合格混合液的无菌试剂瓶进行密封处理，冷藏存储。2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，其特征在于，所述步骤一中非渗透性冷冻保护剂包括羟乙基淀粉、海藻糖、蔗糖、羧甲基纤维素钠中的一种或几种。3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞无血清冻存...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雪梅，刘江，蔡争涛，刘子屹，郭孟洋，
申请(专利权)人：银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：