研究ASXL2/EZH2通过AuroraA调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法技术

本发明专利技术提供了一种研究ASXL2/EZH2通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法。包括以下步骤：S1：分析低氧下小鼠精子中ASXL2、EZH2、Aurora A表达的变化；S2：分析低氧下ASXL2/EZH2和Aurora A的相互作用；S3：检测低氧下ASXL2/EZH2对Aurora A的调控作用；S4：分析Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常的机制。本发明专利技术首次发现并鉴定了ASXL2/EZH2/Aurora A信号通路在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的作用，该信号通路为低氧下精子鞭毛多发形态异常提供了新的治疗途径。精子鞭毛多发形态异常提供了新的治疗途径。

【技术实现步骤摘要】
研究ASXL2/EZH2通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法


[0001]本专利技术涉及重组DNA
，尤其涉及一种研究ASXL2/EZH2通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多形态异常机制的实验方法。

技术介绍

[0002]我国拥有世界上面积最大、海拔最高、居住人口最多的高原，高原地区不仅自然资源丰富。高原低氧(低张性缺氧) 环境对男性生殖功能有显著负面影响，大量关于人类、羊驼、大鼠与小鼠精子(Elongatingspermatid/Spermatozoa,也称为长形精子)鞭毛多发形态异常现象已有报道(LiuX.etc.Biochem Biophys Res Commun,2020)。由高原低氧引起的精子鞭毛多发形态异常继而造成精子前向运动能力降低严重威胁着高原男性人群生殖健康，其直接后果是畸形精子症、弱畸形精子症，严重者可导致男性不育；畸形精子症的不育患者大多存在精子的表观遗传失稳，比如H3K9me3组蛋白甲基化丰度下降及富含组蛋白甲基化的基因启动子减少等(Wang,S.Y.etc.Nat Commun,2016)。高原低氧下精子鞭毛多发形态异常Hypoxic multiplemorphological abnormalities of the sperm flagella,HMMAF)药物治疗效果不佳，对于 HMMAF的遗传学病因和致病机理并不明确。因此，深入研究HMMAF的表观遗传机制，探索有效控制低氧下精子鞭毛多发形态异常发生的方法，对于高原男性生殖防治措施具有十分重要的意义，对于我国高原地区的经济和国防建设也有重大意义。
[0003]Aurora A是Aurora激酶家族中的重要成员之一，在细胞有丝分裂过程中发挥着重要功能，Aurora A的过度表达与人类多种恶性肿瘤紧密相关，但其在高原低氧下精子鞭毛多发形态异常中的作用尚无相关报道。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中所存在的不足，本专利技术提供了一种研究ASXL2/EZH2通过Aurora A 调控低氧下精子鞭毛多形态异常机制的实验方法，其解决了现有技术中低氧下精子鞭毛多发形态异常药物治疗效果不佳，HMMAF的遗传学病因和致病机理不明确的问题。
[0005]本专利技术提供一种研究ASXL2/EZH2通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，包括以下步骤：
[0006]S1：分析低氧下小鼠精子中ASXL2、EZH2、Aurora A表达的变化；
[0007]S2：分析低氧下ASXL2/EZH2和Aurora A的相互作用；
[0008]S3：分析低氧下ASXL2/EZH2对Aurora A的调控作用；
[0009]S4：分析Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常的机制。
[0010]专利技术人在前期实验研究表明ASXL2/EZH2会导致低氧下精子鞭毛多发形态异常，但其作用机制并不明确。专利技术人发现在低氧下小鼠精子内Aurora A呈现差异性表达，因此专利技术人进一步通过实验验证ASXL2/EZH2是否通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异
常。
[0011]进一步地，所述步骤S1包括：
[0012]1)将小鼠放置于低压力低氧浓度的环境中，制备低氧HMMAF模型，并设置对照组；
[0013]2)检测小鼠精子中ASXL2、EZH2、Aurora A的表达。
[0014]优选地，所述压力为360mmHg，所述氧浓度为10％，所述放置的时间为10周。
[0015]优选地，所述对照组为21％氧浓度暴露10周的小鼠。
[0016]进一步地，所述步骤S2包括：
[0017]1)收集小鼠低氧HMMAF模型和对照组的小鼠精子；
[0018]2)ChIP
‑
qPCR分析ASXL2/EZH2和Aurora A的相互作用。
[0019]进一步地，所述步骤S3包括：
[0020]1)构建ASXL2过表达质粒，并设置对照质粒；
[0021]2)将ASXL2过表达质粒和对照质粒分别转入小鼠；
[0022]3)检测低氧下小鼠精子中Aurora A表达的变化。
[0023]优选地，步骤1)中所述ASXL2过表达质粒为重组腺病毒颗粒。
[0024]优选地，步骤3)中所述检测的方法为：通过western blot检测Aurora A蛋白的表达量。
[0025]进一步地，所述步骤S4包括：GST Pull
‑
down分析Aurora A磷酸化MCAK
‑
N端，进而破坏MCAK与TIP150结合。
[0026]相比于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0027]本专利技术首次发现并鉴定了ASXL2/EZH2/Aurora A信号通路在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的作用，研究发现，ASXL2/EZH2可在Aurora A启动子富集，从而使Aurora A 蛋白磷酸化MCAK，阻断了MCAK和TIP150的结合，导致微管正端动态失控，从而影响精子鞭毛的正常形态，使精子活动能力受限，从而导致男性不育。该信号通路为低氧下精子鞭毛多发形态异常提供了新的治疗途径。
附图说明
[0028]图1为本专利技术实施例1中小鼠精子中ASXL2、EZH2、Aurora A的表达效果图。
[0029]图2为本专利技术实施例2中ASXL2/EZH2和Aurora A相互作用的效果图。
[0030]图3为本专利技术实施例3中HBAD
‑
Adeasy
‑
m
‑
Asxl2
‑
3xflag
‑
mCherry的载体图谱。
[0031]图4为本专利技术实施例5中ASXL2、Aurora A的表达效果图。
[0032]图5为本专利技术实施例6中Aurora A磷酸化MCAK的效果图；其中，5A为TIP150域的示意图；5B为MCAK域的示意图；5C为WT验证Aurora A对MCAK 5S的磷酸化。
具体实施方式
[0033]下面结合附图及实施例对本专利技术中的技术方案进一步说明。
[0034]实施例1低氧下小鼠精子中ASXL2、EZH2、Aurora A的变化
[0035]1、制备小鼠低氧HMMAF模型：将小鼠置于模拟海拔5800m高原低压氧舱内(压力：约360mmHg，氧含量10％)，连续低压低氧处理10w来复制小鼠低氧HMMAF模型。经鉴定低氧HMMAF模型复制成功。并设置21％氧浓度暴露10周组小鼠为对照组。
[0036]2、精子采集：打开腹腔，取出附睾组织，摘取双侧附睾尾进行液化与裂解后，得到精子(长形精子)。Western blot检测附睾尾精子中ASXL2、EZH2、Aurora A的表达。结果如图1所示。具体方法如下：
[0037](1)蛋白准备
[0038]1)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.研究ASXL2/EZH2通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：分析低氧下小鼠精子中ASXL2、EZH2、Aurora A表达的变化；S2：分析低氧下ASXL2/EZH2和Aurora A的相互作用；S3：检测低氧下ASXL2/EZH2对Aurora A的调控作用；S4：分析Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常的机制。2.如权利要求1所述的研究ASXL2/EZH2通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述步骤S1包括：1)将小鼠放置于低压力低氧浓度的环境中，制备低氧HMMAF模型，并设置对照组；2)检测小鼠精子中ASXL2、EZH2、Aurora A的表达。3.如权利要求2所述的研究ASXL2/EZH2通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述压力为360mmHg，所述氧浓度为10％，所述放置的时间为10周。4.如权利要求2所述的研究ASXL2/EZH2通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述对照组为21％氧浓度暴露10周的小鼠。5.如权利要求1所述的研究ASXL2/EZH2通过Aurora A调控低氧下精子鞭毛多发形态异常机制的实验方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：何为，黄艺，何乐春，
申请(专利权)人：重庆艾令达生物医学研究有限公司，
类型：发明
国别省市：