发酵液中C制造技术

本发明专利技术公开了一种发酵液中C

【技术实现步骤摘要】
发酵液中C
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甾类物质含量的测定体系及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于中药成份分析
，尤其涉及一种发酵液中C
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甾类物质含量的测定体系及其构建方法，以及该测定体系在测定植物(白首乌)内生菌发酵液中C
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甾类物质含量的应用。

技术介绍

[0002]C
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甾类物质在抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、保护肝脏、抗抑郁等方面具有显著的生物活性，其主要存在萝蘼、通关藤、白首乌、青阳参和黑蔓藤等植物中。白首乌作为萝藦科植物中的一种，其块根中存在最多的活性成分即为C
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甾类化合物。研究表明，植物内生菌能够产生与宿主相同或相似的代谢产物，特别是药用植物可以从内生菌代谢物中寻找筛选具有药用活性的物质来替代稀缺珍贵、生长周期慢的宿主植物，植物内生菌可以作为新型药物来源，在一定程度上解决药物生长缓慢、资源短缺等问题。利用微生物发酵途径生产制备此类产品在农业、医药及其他产业具有较广阔的应用前景。
[0003]C
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甾类化合物含量测定方法较多，主要有香草醛比色法和磺基醋酸汞比色法两大反应体系。香草醛比色法常用的比色体系有香草醛
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高氯酸、香草醛
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盐酸等。邓志勇等运用香草醛
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高氯酸比色法对总皂苷、总三萜酸进行含量测定，但香草醛
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高氯酸法批间精密度差，且高氯酸性质不稳定，实验过程中易分解；田建华建立盐酸
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香草醛比色法适用于测定原花青素的含量，盐酸作为反应体系的氧化剂，其与香草醛发生显色反应，其灵敏性较低。本专利技术前期探究了磺基醋酸汞比色法在发酵液中C
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甾类化合物的测定，发现发酵液样品测定中存在显色不稳定、基础培养基组分对样品检测有干扰等问题。

技术实现思路

[0004]为克服现有技术的缺点和不足，本专利技术的首要目的在于提供一种C
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甾类物质含量的测定体系。
[0005]本专利技术的再一目的在于提供上述测定体系的构建方法。
[0006]为克服现有技术的缺点和不足，本专利技术的另一目的在于提供上述测定体系在测定植物(白首乌)内生菌发酵液中C
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甾类物质含量中的应用。
[0007]本专利技术是这样实现的，一种发酵液中C
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甾类物质含量的测定体系的构建方法，该方法包括以下步骤：
[0008](1)标准溶液的制备
[0009]将孕甾烯醇酮标准品溶解到乙醇中得到母液，用乙醇稀释母液得到设定浓度的标准品母液，在0.2mL～4.0mL范围内，取不同体积的标准品母液于试管中得到不同孕甾烯醇酮含量的标准溶液；
[0010](2)最佳测定波长的确定
[0011]将步骤(1)所述的标准溶液通过水浴加热挥干，往挥干后的试管中加入 0.4mL 5％wt香草醛
‑
冰乙酸和0.6mL浓硫酸，混匀、加塞，通过60℃水浴加热反应30min，冰水浴终
止反应，加入10mL冰乙酸混匀，采用全波段扫描，根据不同波长下吸收峰值，确定各标准溶液的最佳测定波长；
[0012](3)最佳测定条件的确定
[0013]通过正交试验设计检测步骤(2)中不同水浴温度、反应时间、香草醛
‑
冰乙酸浓度对C
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甾类物质含量测定的影响，在步骤(2)确定的最佳测定波长条件下，测定标准溶液的吸光度，根据不同反应条件下标准溶液的浓度与吸光值之间的相关性，确定C
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甾类物质的最佳测定条件；
[0014](4)标准曲线的制备
[0015]将步骤(1)所述的标准溶液通过水浴加热挥干，在步骤(3)确定的最佳测定条件下反应至结束，冰水浴终止反应，加入10mL冰乙酸混匀，以未添加孕甾烯醇酮的乙醇溶液为空白对照，在步骤(2)的最佳测定波长条件下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以C
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甾类物质含量为横坐标，绘制标准曲线。
[0016]优选地，在步骤(1)中，所述标准品母液的浓度为0.15mg/mL；所述母液中孕甾烯醇酮、乙醇的质量体积比为0.75g：5mL。
[0017]优选地，在步骤(1)中，各标准品母液的体积为0.2mL、0.5mL、1mL、 1.5mL、2.0mL、4.0mL。
[0018]优选地，在步骤(2)、步骤(4)中，挥干标准溶液的水浴温度为70℃。
[0019]优选地，在步骤(2)中，所述最佳测定波长为450nm。
[0020]优选地，在步骤(3)中，进行单因素与正交实验，对显色温度，显色时间和显色剂浓度进行优化，所述最佳测定条件为：往挥干后的试管中加入0.4mL 7％wt香草醛
‑
冰乙酸和0.6mL浓硫酸，混匀、加塞，通过75℃水浴加热反应 24min。
[0021]本专利技术进一步公开了由上述构建方法得到的测定体系，该测定体系包括最佳测定波长、最佳测定条件以及标准曲线。
[0022]优选地，所述最佳测定波长为450nm，所述最佳测定条件为：往挥干后的试管中加入0.4mL 7％wt香草醛
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冰乙酸和0.6mL浓硫酸，混匀、加塞，通过75℃水浴加热反应24min。
[0023]本专利技术进一步公开了上述测定体系在测定植物内生菌发酵液中C
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甾类物质含量中的应用，该应用包括以下步骤：
[0024](1)供试样品溶液的制备
[0025]将具有C
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甾类物质合成能力的植物内生菌培养至次级代谢期，收集发酵液，离心，取1mL上清液在所述最佳测定条件下反应至结束，冰水浴终止反应，加入10mL冰乙酸，混匀，得到供试样品溶液；
[0026](2)白首乌内生菌发酵液C
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甾类物质含量测定
[0027]将所述供试样品溶液在所述最佳测定波长下测定吸光度，参照所述标准曲线分析白首乌内生菌发酵液中C
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甾类物质的含量。
[0028]优选地，所述植物内生菌为白首乌内生菌。
[0029]本专利技术克服现有技术的不足，提供一种发酵液中C
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甾类物质含量的测定体系及其构建方法与应用。本专利技术测定体系的构建过程为：以孕烯醇酮为标准品配制梯度标准溶液，通过全波段扫描，确定最佳测定波长；采用正交实验设计，确定C
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甾类物质含量测定的最佳测定条件(包括最佳温度、最佳反应时间及最佳香草醛
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冰乙酸浓度)；在该最佳测定条件
下，建立标准曲线。该构建过程中得到的最佳测定波长、最佳测定条件、标准曲线构成该测定体系，可应用在植物(白首乌)内生菌发酵液中C
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甾类物质含量测定中，通过待测内生菌发酵液制备成供试样品，测定其吸光度，并根据建立的标准曲线分析，即可获得样品中C
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甾类物质的含量。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种发酵液中C
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甾类物质含量的测定体系的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)标准溶液的制备将孕甾烯醇酮标准品溶解到乙醇中得到母液，用乙醇稀释母液得到设定浓度的标准品母液，在0.2mL～4.0mL范围内，取不同体积的标准品母液于试管中得到不同孕甾烯醇酮含量的标准溶液；(2)最佳测定波长的确定将步骤(1)所述的标准溶液通过水浴加热挥干，往挥干后的试管中加入0.4mL 5％wt香草醛
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冰乙酸和0.6mL浓硫酸，混匀、加塞，通过60℃水浴加热反应30min，冰水浴终止反应，加入10mL冰乙酸混匀，采用全波段扫描，根据不同波长下吸收峰值，确定各标准溶液的最佳测定波长；(3)最佳测定条件的确定通过正交试验设计检测步骤(2)中不同水浴温度、反应时间、香草醛
‑
冰乙酸浓度对C
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甾类物质含量测定的影响，在步骤(2)确定的最佳测定波长条件下，测定标准溶液的吸光度，根据不同反应条件下标准溶液的浓度与吸光值之间的相关性，确定C
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甾类物质的最佳测定条件；(4)标准曲线的制备将步骤(1)所述的标准溶液通过水浴加热挥干，在步骤(3)确定的最佳测定条件下反应至结束，冰水浴终止反应，加入10mL冰乙酸混匀，以未添加孕甾烯醇酮的乙醇溶液为空白对照，在步骤(2)的最佳测定波长条件下测定吸光度，以吸光度为纵坐标，以C
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甾类物质含量为横坐标，绘制标准曲线。2.如权利要求1的测定体系的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述标准品母液的浓度为0.15mg/mL；所述母液中孕甾烯醇酮、乙醇的质量体积比为0.75g：5mL...

【专利技术属性】
技术研发人员：王欢莉，康贻军，蒋晶，王成，姚瑶，顾琪，宋慧敏，胥宝丹，崔国强，
申请(专利权)人：盐城师范学院，
类型：发明
国别省市：