一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法技术

本发明专利技术提供一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法，包括：将黏膜标本固定后，放入不同浓度的丙酮溶液中多次浸泡，洗涤；黏膜标本采用CUBIC

【技术实现步骤摘要】
一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法


[0001]本专利技术涉及三维成像
，特别是涉及一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法。

技术介绍

[0002]淋巴管是组织间液回流至循环系统的通道，因淋巴几乎无色透明，故肉眼不可见。而淋巴管是食管癌转移的主要方式，因此观察淋巴管的形态或许有助于提供肿瘤转移的相关信息。虽然临床上存在诸如淋巴管造影、SPECT、MRI淋巴管序列、局部注射亚甲蓝或吲哚菁绿显示引流淋巴管等方法，但均因有创、分辨率低而无法观察直径在10μm
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300μm的食管黏膜淋巴管。消化内镜是观察食管黏膜最直接、最清晰的技术手段，放大内镜可以窥见10μm左右的上皮乳头内毛细血管袢，但依然无法窥见无色的淋巴管。
[0003]鉴于此，目前只能通过组织病理手段得以窥见淋巴管的一“斑”。传统病理技术是将组织做石蜡或冰冻切片，通过免疫组化或免疫荧光将淋巴管的横截面显示出来。后来出现了基于共聚焦、双光子、光片设备的整体组织免疫荧光成像技术，可观察小鼠皮肤或黏膜的淋巴管三维结构。但由于人体食管黏膜标本显著厚于小鼠组织，激光穿透力低，且食管鳞状上皮的透光性也很差，故上述方法也无法显示淋巴管结构。由此，需要借助一种透明化技术以增加激光的组织穿透力。目前比较主流的透明化技术为DISCO和CUBIC，透明化效果均较好。前者需要使组织脱水，黏膜组织内部变形严重，而第一代CUBIC方案组织膨胀及荧光淬灭较严重。采用第二代CUBIC
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L/CUBIC
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R+方案则可以在维持组织正常形态的同时，达到较好的组织透明度及荧光保存度。
[0004]然而，CUBIC方法主要用于基础动物实验，其荧光染色主要是通过转基因或化学试剂，而非免疫荧光染色。而人体标本无法做上述处理进行目标靶点成像。因此，目前尚没有指导免疫荧光染色联合CUBIC透明化处理人体消化道黏膜标本来展示完整的淋巴管网络形态的标准化流程的方案。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法，包括如下步骤：
[0007]步骤一、将黏膜标本固定后，放入不同浓度的丙酮溶液中多次浸泡，洗涤；
[0008]步骤二、黏膜标本采用CUBIC
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L试剂进行梯度浸泡脱色、脱脂；
[0009]步骤三、黏膜标本采用一抗室温孵育，洗涤后采用二抗室温孵育，洗涤；其中，所述一抗为针对目标组织靶抗原的抗体；二抗为带荧光标记的抗体；
[0010]步骤四、黏膜标本采用不同浓度的CUBIC
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R+试剂进行折光率匹配至黏膜标本透明；
[0011]步骤五、透明后的标本于共聚焦、双光子或光片显微镜下进行Z轴拍摄，即得。
[0012]本专利技术主要适用于食管黏膜(也可推及胃黏膜及肠黏膜)，通过免疫荧光染色与CUBIC
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L/R+试剂结合，从而处理标本使其在组织透明化的过程中还能保证标本的完整性。本方法虽然采用CUBIC透明化处理，但是仍可保持标本的完整性，避免组织变形；还可完整展示食管黏膜层的淋巴管，深度可达1000μm；也可保持荧光强度在一周内不减弱，使用免疫荧光染色与CUBIC
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L/R+试剂结合可以较长时间保持荧光不淬灭，便于反复拍摄或保存至可拍摄的时间，更利于实验操作。
[0013]本专利技术在标本处理的过程中预先采用丙酮进行处理，丙酮有一定的组织通透作用，还可能存在脱去脂褐素一类色素的作用，由此更利于后续组织染色及透明化处理，同时减少非特异性荧光背景。之后采用CUBIC
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L试剂梯度浸泡方法脱色、脱脂，既能防止标本直接进入原液导致的脱水、变形和组织破坏，也能保证标本透明化。再采用一抗、二抗进行免疫荧光染色。最后采用CUBIC
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R+梯度浸泡，一方面是进行折光率匹配使组织变得透明而易于光线透过，另一方面也可以达到防止标本直接进入原液导致的脱水、变形和组织破坏的作用。最后进行黏膜组织的淋巴管三维结构成像，组织形态保存好，成像深度满意
[0014]于本专利技术的一实施例中，所述步骤一中黏膜标本固定的具体操作为：将手术获取的黏膜标本放入5～15％的中性福尔马林进行固定；
[0015]所述步骤一中不同浓度的丙酮溶液中多次浸泡的具体操作为：将黏膜标本依次放入第一丙酮溶液、第二丙酮溶液和第三丙酮溶液中浸泡，所述第二丙酮溶液的浓度均高于第一丙酮溶液和第三丙酮溶液。
[0016]丙酮有一定的组织通透作用，还可脱去脂褐素一类色素的作用。本专利技术采用多种浓度的丙酮溶液进行处理，更利于后期标本染色和透明化，利于成像。
[0017]于本专利技术的一实施例中，所述第一丙酮溶液的浓度为20～30％；
[0018]所述第二丙酮溶液的浓度为40～60％；
[0019]所述第三丙酮溶液的浓度为20～30％。
[0020]于本专利技术的一实施例中，所述步骤二中CUBIC
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L试剂进行梯度浸泡的具体操作为：黏膜标本采用第一CUBIC
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L试剂浸泡后，再采用第二CUBIC
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L试剂浸泡，洗涤；其中，所述第一CUBIC
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L试剂中CUBIC
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L的体积分数为(40～60)％，第二CUBIC
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L试剂中CUBIC
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L的体积分数为(90～100)％；(经CUBIC
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L脱色、脱脂后的标本可于30％蔗糖/PBS溶液中4℃保存直至开始染色)
[0021]所述步骤四中不同浓度的CUBIC
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R+试剂进行折光率匹配的具体操作为：黏膜标本采用第一CUBIC
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R+试剂进行折光率匹配，再采用第二CUBIC
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R+试剂进行折光率匹配至黏膜标本透明；其中，所述第一CUBIC
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R+试剂中CUBIC
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R+体积分数为(40～60)％，所述第二CUBIC
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R+试剂中CUBIC
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R+体积分数为(90～100)％。
[0022]一般而言，CUBIC
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L、CUBIC
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R+实际都是采用蒸馏水稀释。
[0023]于本专利技术的一实施例中，所述第一CUBIC
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L试剂中CUBIC
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L的体积分数为(45～55)％，第二CUBIC
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L试剂中CUBIC
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L的体积分数为(95～100)％；
[0024]所述第一CUBIC
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R+试剂中CUBIC
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R+体积分数为(45～55)％，所述第二CUBIC
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、将黏膜标本固定后，放入不同浓度的丙酮溶液中多次浸泡，洗涤；步骤二、黏膜标本采用CUBIC
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L试剂进行梯度浸泡脱色、脱脂；步骤三、黏膜标本采用一抗室温孵育，洗涤后采用二抗室温孵育，洗涤；其中，所述一抗为针对目标组织靶抗原的抗体；二抗为带荧光标记的抗体；步骤四、黏膜标本采用不同浓度的CUBIC
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R+试剂进行折光率匹配至黏膜标本透明；步骤五、透明后的标本于共聚焦、双光子或光片显微镜下进行Z轴拍摄，即得。2.根据权利要求1所述的一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法，其特征在于：所述步骤一中黏膜标本固定的具体操作为：将黏膜标本放入5～15％的中性福尔马林进行固定；所述步骤一中不同浓度的丙酮溶液中多次浸泡的具体操作为：将黏膜标本依次放入第一丙酮溶液、第二丙酮溶液和第三丙酮溶液中浸泡，所述第二丙酮溶液的浓度均高于第一丙酮溶液和第三丙酮溶液。3.根据权利要求2所述的一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法，其特征在于：所述第一丙酮溶液的浓度为20～30％；所述第二丙酮溶液的浓度为40～60％；所述第三丙酮溶液的浓度为20～30％。4.根据权利要求1～3任一项所述的一种结合免疫荧光染色的黏膜淋巴管整体成像的方法，其特征在于：所述步骤二中CUBIC
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L试剂进行梯度浸泡的具体操作为：黏膜标本采用第一CUBIC
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L试剂浸泡后，再采用第二CUBIC
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L试剂浸泡，洗涤；其中，所述第一CUBIC
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L试剂中CUBIC
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L的体积分数为(40～60)％，第二CUBIC
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L试剂中CUBIC
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L的体积分数为(90～100)％；所述步骤四中不同浓度的CUBIC
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R+试剂进行折光率匹配的具体操作为：黏膜标本采第一CUBIC
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R+试剂进行折光率匹配，再采用第二CUBIC
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R+试剂进行折光率匹配至黏膜标本透明；其中，所述第一CUBIC
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R+试剂中CUBIC
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R+体积分数为(40～60)％，所述第二CUBI...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡兵，张宇航，武振汝，何龙，冯亦龙，曾宪晖，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：