一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺制造技术

本发明专利技术公开了一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺，通过MDCK细胞的微载体培养方法制备的微载体细胞收集后,将收集的微载体细胞经过MDCK细胞悬浮驯化方法进行驯化；本发明专利技术采用微载体培养细胞一次性的收集大批量细胞继而进行悬浮驯化的工艺，大大缩减了常规使用方瓶培养细胞获得大量细胞悬液的时间；使用驯化培养基连续传代培养MDCK细胞，解决了驯化过程中出现的细胞结团和挂壁的问题，使用低速离心和加入新鲜健康的细胞拯救停止生长或活率出现下降的细胞。现下降的细胞。现下降的细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺。

技术介绍

[0002]MDCK细胞(Madin
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Daby Canine Kidney Cells,MDCK)由Madin和Darby在1958年从健康的雄性可卡猎犬的肾脏中分离的上皮样细胞。通常是以贴壁的方式生长培养。由于MDCK细胞病毒感染率高、增值快和不易变异等优点，该细胞系已被广泛用于多种病毒的扩增和纯化，如腺病毒(Adenovirus)、犬细小病毒(Canine parvovirus，CPV)、禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)、流感病毒(Influenza virus，IV)等。
[0003]MDCK细胞是贴壁生长的细胞，贴壁状态下有一个很明显的适应性优势，对借剪切力和通气方式都不敏感。通过微载体的贴壁培养是MDCK细胞大规模培养的策略之一，目前，Cytodex 1和Cytodex 3两种实心微载体在MDCK细胞中使用较多。Cytodex 1以交联葡聚糖基架为基础，该基架被带正电荷的N,N二乙胺基乙基基团取代，该带电集团遍布于整个微载体基架中。Cytodex 3上的变性胶原层易被胰蛋白酶和胶原酶等多种蛋白酶消化，因此，能在维持细胞最大活性、功能和完整性的同时将细胞从微载体上分离出来。不同的微载体会影响细胞的生长情况，所以，对不同微载体的选择时MDCK细胞大规模培养的首要问题。
[0004]第一株成功悬浮驯化的报道是Capstick等对BHK
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21细胞驯化实现悬浮培并用于兽用疫苗生产。之后悬浮驯化出了悬浮的CHO、MDCK等细胞。至今贴壁细胞的悬浮已经经历了几十年，使用的驯化工艺大多为逐步降低血清更换培养基后，逐步提速适应的方法，该方法驯化时间漫长(5
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10个月)且存在较大的失败概率，即使驯化成功，也容易出现细胞易结团、活率低、倍增时间长等缺点。至今没有效果突出的驯化工艺，因此，提供一种性能优异的培养基及培养方法十分必要。
[0005]1967年，Van Wezel开发了微载体并实现生物反应器中大规模培养贴壁细胞。而将微载体培养运用于悬浮驯化的研究鲜有报道，然而使用微载体可以在短时间内获得大量的细胞悬液，而细胞密度对悬浮驯化的初期是比较关键的因素。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺，以解决现有技术的上述问题。
[0007]本专利技术的方案是：
[0008]一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺，通过MDCK细胞的微载体培养方法制备的微载体细胞收集后,将收集的微载体细胞经过MDCK细胞悬浮驯化方法进行驯化。
[0009]作为优选的技术方案，所述MDCK细胞的微载体培养方法包括下列步骤：
[0010]1)微载体预处理，将2～5g/L的量称取Cytodex系列的干粉微载体，用pH为7.4的PBS缓冲液泡发所述干粉微载体4～18h，PBS清洗两次，高压灭菌，冷却静置，微载体使用前用微载体培养基清洗2～3遍后，然后定容在2％血清的微载体培养基中；
[0011]2)MDCK种子细胞复苏，从液氮中取出冻存的MDCK细胞，在37℃～39℃的水浴中快速搅动2分钟以复苏细胞，复苏后用10％FBS DMEM的细胞培养液在T125方瓶中培养至细胞生长到T125方瓶生长面90％以上致密；
[0012]3)MDCK种子细胞传代，细胞汇合度大于95％时进行传代培养，弃掉旧的培养液，用PBS清洗3遍以上，加入5ml的0.25％的胰酶37℃消化5～10分钟后，弃掉消化液，上下左右轻拍方瓶，让残留的消化液渗透到每一个细胞，继续37℃2～5分钟，直至轻拍T125方瓶底部，细胞成片均匀脱落，加入适量的传代培养基，按照1：5～1：20的传代比例接种传代；
[0013]4)MDCK种子细胞的培养基适应，按照步骤3)中进行的传代细胞直接转移至不含微载体的微载体培养基中，适应一代即可；
[0014]5)微载体接种：将传代5次后的MDCK细胞悬液制成密度为1000个细胞/ml的细胞悬液，加入2％血清的微载体培养基；
[0015]6)微载体吸附，将步骤5)中含有MDCK细胞悬液的微载体培养基放入方瓶中，将所述方瓶放在侧摆摇床上，然后一起放入二氧化碳培养箱中缓慢摇动，培养8～12小时；
[0016]7)微载体培养，将含有MDCK细胞悬液的微载体培养基吹悬后，将方瓶中的含有MDCK细胞悬液的微载体培养基转入125ml的摇瓶中，轴距50mm的摇床转速为110～130rpm、体积分数为5～8％CO2、36～38℃条件下继续培养24小时；
[0017]8)微载体扩大培养，微载体细胞爬满载体并出现载体粘黏的时候，取出125ml的摇瓶静置2
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4分钟，弃掉使用的微载体培养基，PBS清洗3遍含细胞的微载体，加入0.25％胰酶，110rpm、5％二氧化碳浓度、37℃条件下消化2小时；消化静置后，取消化上清液离心收集细胞，将消化上清细胞悬液转移至50ml离心管中，1000rpm、5min离心收集细胞；
[0018]将步骤1)中微载体量按照1：10的体积扩大培养，然后将消化后的细胞重悬于2％血清的微载体培养基中，然后装入新摇瓶中，细胞吸附载体培养条件培养4～12小时，细胞吸附载体培养条件为温度36～38℃，体积分数为5～8％CO2，转速为80～110rpm；所述细胞吸附载体培养条件完成后改为细胞在载体上的培养条件，细胞在载体上的培养条件为温度36～38℃，体积分数为5～8％CO2，转速为110～130rpm，时间24
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48小时；镜检观察载体细胞载量达到80％为止开始收获细胞，两天更换一次培养液。
[0019]作为优选的技术方案，所述步骤1)为3g/L的量称取Cytodex系列的干粉微载体；所述步骤8)中细胞收获量最大集中在消化后清洗的第3～5次；所述步骤8)中进行反复多次的加入无菌的PBS清洗消化后的微载体并离心收集上清中的细胞，获得细胞。
[0020]作为优选的技术方案，所述步骤3)中胰酶消化条件为消化进行两次孵育，第一次让胰酶整体浸泡细胞，分离细胞与细胞之间，细胞与瓶底之间的连接；第二次吸弃流动的胰酶后，继续孵育5～10分钟，目的位分离细胞与瓶底，此时轻拍瓶底，细胞会成片脱落分离，再加入新鲜传代培养基吹匀细胞可以得到均匀分散的细胞悬液。
[0021]作为优选的技术方案，所述MDCK细胞悬浮驯化方法包括下列步骤：
[0022]1)初代悬浮细胞获得，将收集的微载体细胞静置沉降，吸弃上清；通过PBS缓冲液洗涤3～8次，吸弃PBS缓冲液后加入胰酶，放入摇床通过培养模式进行消化，消化2小时后取出消化细胞液，静置3分钟后取细胞上清液，3～8次加入洗涤液清洗微载体上脱落的细胞并收集上清液，将收集的上清液装入离心管，离心，室温，1000rpm，5分钟收集，倒掉收集本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺，其特征在于：通过MDCK细胞的微载体培养方法制备的微载体细胞收集后,将收集的微载体细胞经过MDCK细胞悬浮驯化方法进行驯化。2.如权利要去1所述一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺，其特征在于，所述MDCK细胞的微载体培养方法包括下列步骤：1)微载体预处理，将2～5g/L的量称取Cytodex系列的干粉微载体，用pH为7.4的PBS缓冲液泡发所述干粉微载体4～18h，PBS清洗两次，高压灭菌，冷却静置，微载体使用前用微载体培养基清洗2～3遍后，然后定容在2％血清的微载体培养基中；2)MDCK种子细胞复苏，从液氮中取出冻存的MDCK细胞，在37℃～39℃的水浴中快速搅动2分钟以复苏细胞，复苏后用10％FBSDMEM的细胞培养液在T125方瓶中培养至细胞生长到T125方瓶生长面90％以上致密；3)MDCK种子细胞传代，细胞汇合度大于95％时进行传代培养，弃掉旧的培养液，用PBS清洗3遍以上，加入5ml的0.25％的胰酶37℃消化5～10分钟后，弃掉消化液，上下左右轻拍方瓶，让残留的消化液渗透到每一个细胞，继续37℃2～5分钟，直至轻拍T125方瓶底部，细胞成片均匀脱落，加入适量的传代培养基，按照1：5～1：20的传代比例接种传代；4)MDCK种子细胞的培养基适应，按照步骤3)中进行的传代细胞直接转移至不含微载体的微载体培养基中，适应一代即可；5)微载体接种：将传代5次后的MDCK细胞悬液制成密度为1000个细胞/ml的细胞悬液，加入2％血清的微载体培养基；6)微载体吸附，将步骤5)中含有MDCK细胞悬液的微载体培养基放入方瓶中，将所述方瓶放在侧摆摇床上，然后一起放入二氧化碳培养箱中缓慢摇动，培养8～12小时；7)微载体培养，将含有MDCK细胞悬液的微载体培养基吹悬后，将方瓶中的含有MDCK细胞悬液的微载体培养基转入125ml的摇瓶中，轴距50mm的摇床转速为110～130rpm、体积分数为5～8％CO2、36～38℃条件下继续培养24小时；8)微载体扩大培养，微载体细胞爬满载体并出现载体粘黏的时候，取出125ml的摇瓶静置2
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4分钟，弃掉使用的微载体培养基，PBS清洗3遍含细胞的微载体，加入0.25％胰酶，110rpm、5％二氧化碳浓度、37℃条件下消化2小时；消化静置后，取消化上清液离心收集细胞，将消化上清细胞悬液转移至50ml离心管中，1000rpm、5min离心收集细胞；将步骤1)中微载体量按照1：10的体积扩大培养，然后将消化后的细胞重悬于2％血清的微载体培养基中，然后装入新摇瓶中，细胞吸附载体培养条件培养4～12小时，细胞吸附载体培养条件为温度36～38℃，体积分数为5～8％CO2，转速为80～110rpm；所述细胞吸附载体培养条件完成后改为细胞在载体上的培养条件，细胞在载体上的培养条件为温度36～38℃，体积分数为5～8％CO2，转速为110～130rpm，时间24
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48小时；镜检观察载体细胞载量达到80％为止开始收获细胞，两天更换一次培养液。3.如权利要去2所述一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺，其特征在于：所述步骤1)为3g/L的量称取Cytodex系列的干粉微载体；所述步骤8)中细胞收获量最大集中在消化后清洗的第3～5次；所述步骤8)中进行反复多次的加入无菌的PBS清洗消化后的微载体并离心收集上清中的细胞，获得细胞。4.如权利要去2所述一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺，其特征在于：所述步骤
3)中胰酶消化条件为消化进行两次孵育，第一次让胰酶整体浸泡细胞，分离细胞与细胞之间，细胞与瓶底之间的连接；第二次吸弃流动的胰酶后，继续孵育5～10分钟，目的位分离细胞与瓶底，此时轻拍瓶底，细胞会成片脱落分离，再加入新鲜传代培养基吹匀细胞可以得到均匀分散的细胞悬液。5.如权利要求1所述的所述一种MDCK细胞微载体培养及悬浮驯化工艺，其特征在于，所述MDCK细胞悬浮驯化方法包括下列步骤：1)初代悬浮细胞获得，将收集的微载体细胞静置沉降，吸弃上清；通过PBS缓冲液洗涤3～8...

【专利技术属性】
技术研发人员：王龙，姚芸，王猛，
申请(专利权)人：无锡多宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：