血栓形成导致复发流产风险基因检测引物及评估模型制造技术

本发明专利技术涉及血栓形成导致复发流产风险基因检测引物及评估模型，属于分子生物学及生物信息学领域，具体为：基于多重PCR扩增及毛细管电泳检测多个SNP，并通过回归预测模型的构建，对纳入的SNP位点赋予不同权重，进行打分，并最终对待测样本的血栓风险进行归类和评估。本发明专利技术公开了血栓形成导致复发流产风险基因，包括设定的11个基因名称和对应的12个位点、以及上述12个位点对应的引物。本发明专利技术还同时公开了血栓形成导致复发流产风险基因的评估模型以及相应的评估模型的使用方法。相应的评估模型的使用方法。相应的评估模型的使用方法。

【技术实现步骤摘要】
血栓形成导致复发流产风险基因检测引物及评估模型


[0001]本专利技术属于分子生物学及生物信息学领域，尤其是涉及一种基于多重PCR扩增及毛细管电泳检测多个SNP，并通过回归预测模型的构建，对纳入的SNP位点赋予不同权重，进行打分，并最终对待测样本的血栓风险进行归类和评估。

技术介绍

[0002]复发性自然流产(RSA)是指连续发生2次或2次以上的自然流产，其病因错综复杂，目前比较明确的病因有遗传因素、内分泌因素、免疫因素、血栓前状态(PTS)及解剖因素等，但因为缺乏特异性表现，临床上对其难以做出准确的病因诊断，容易忽略某些相关因素而影响活产率。不明原因的习惯性流产不仅给患者的精神和身体带来严重的创伤，也给家庭带来极大痛苦。
[0003]目前对不明原因习惯性流产的免疫遗传学病因的研究日益增多，各国学者致力于寻找习惯性流产的易感基因，易感基因的筛选主要集中在与习惯性流产危险因素相关的基因上。研究表明，习惯性流产是由母体内分泌、代谢以及免疫因素异常引起的。
[0004]纯合型MTHFR基因突变是高同型半胱氨酸血症的常见原因。高同型半胱氨酸血症造成内皮结构损伤、功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，破坏机体凝血和纤溶系统的平衡，影响脂质代谢，使机体处于高凝状态，容易形成血栓。高同型半胱氨酸血症与胎盘早剥、胎儿生长受限、低出生体重儿及子痫前期的发生有关。MTHFR在高同型半胱氨酸代谢中起着十分重要的作用，MTHFR基因常见的变异型是MTHFR677T，该变异型基因携带者常常伴有轻度高同型半胱氨酸水平升高，在高加索人群中MTHFR677T基因相当普遍，纯合子携带者就占总人群的10％，但高同型半胱氨酸水平却轻微升高，因此很难估测MTHFR基因突变对血栓危险性的影响。Nelen等对10个多中心的临床资料进行病例对照研究发现，高同型半胱氨酸血症患者发生复发性流产的概率增加了3～4倍。纯合型的MTHFR C677T和A1298C具有多态性分布，在欧洲人中分别为10％～16％和4％～6％。然而，不管在妊娠妇女或者非妊娠妇女中，并没有明确的研究结果显示MTHFR基因突变会增加静脉血栓发生的风险。虽然有报道高同型半胱氨酸血症是静脉血栓形成的中度危险因素，但是有最新研究显示高同型半胱氨酸水平的升高只是静脉血栓形成的一个微小危险因素。
[0005]纤溶酶原激活物抑制剂
‑
1(PAI
‑
1))是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一员，是尿激酶型纤溶酶原激活物及组织型纤溶酶原激活物的主要的生理性的控制因子，PAI
‑
1的水平上升与动脉血栓相关联,血浆PAI
‑
1浓度升高，使纤溶酶原转化为纤溶酶减少，引起血循环中纤维蛋白和纤维蛋白原积聚，血液高凝，血栓形成。有研究表明，PAI
‑
1水平与4G\5G基因多态性存在相关性。
[0006]凝血酶原(凝血因子Ⅱ)是一种维生素K依赖性蛋白，分子量为72kD，由579个氨基酸残基组成；凝血酶原基因定位于11p11～q12，全长21kb，包含有14个外显子和13个内含子。凝血酶原基因G20210A突变是比凝血因子V基因Leiden突变相对较弱的静脉血栓栓塞(venous thromboembolism，VTE)危险因素。1996年，Poort等发现凝血酶原基因3
′
端非转录
区20210位鸟嘌呤突变为腺嘌呤(G
‑
A)，此突变可增高血浆凝血酶原的水平，同时增高静脉血栓发生的风险。突变在正常妊娠期妇女中的发生率为1％～3％，在不良结局妊娠妇女中的发生率为10％左右，与胎儿生长受限、子痫前期、复发性流产、早产和胎盘早剥的发生有关。
[0007]不同的遗传性血栓发生的原因，对应不同的治疗和干预手段，比如对亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因表达异常所致的高半胱氨酸血症患者补充叶酸、维生素B6和B12。如factorVLeiden基因突变、蛋白S或蛋白C缺乏者孕期可考虑应用肝素抗凝治疗。因此，对于不明原因复发流产的孕妇，或者已经病理发现有血栓的孕妇，进行遗传性血栓风险评估，对于治疗和再生育有着重要的作用。
[0008]传统各研究一般都是单因素分析，但按单个因素进行复发流产的预测或者回顾，其准确率，阳性率都不高。因此需要对现有技术进行改进。
[0009]CN201610940238.1专利，只是检测了叶酸代谢关键酶2个基因，共3个多态性位点用来预测血栓形成；专利CN201310461481.1则只检测了MTHFR一个基因，1个位点用来预测血栓形成；CN109055368B专利，则检测了PAI
‑
1及F5两个基因，共2个多态性位点来预测血栓形成。上述现有技术，最终只是给出一个分型结果，但是无法告知风险，因此缺乏标准化的判断标准；容易出现人为因素下的判断偏差。
[0010]CN201710309444.7专利，虽然检测的内容非常多，包括18个基因全部外显子以及三个基因特定多态性，虽然检测基因很多，但最终结果也只是给出这么多基因中的突变列表，并没有给出任何临床参考值。任何一个普通人检测这么多基因，这么多区域，都有可能找到若干个突变位点，如果按找到1个就算高危，那可能所有人都是高危。此法忽视了基因的权重，且导致不同医生对不同突变导致的血栓理解不同，会导致干预治疗手段差异。

技术实现思路

[0011]本专利技术要解决的技术问题是提供一种血栓形成导致复发流产风险基因检测引物及评估模型。
[0012]为了解决上述问题，本专利技术提供一种血栓形成导致复发流产风险基因，根据基因权重，设定的基因名称和对应的位点、rs编号如下：
[0013]基因名称位点rs编号F2G20210Ars1799963F5G1691Ars6025IL10c.
‑
149+2211A>Grs1800871PAI
‑1‑
675 4G/5Grs1799768MTHFRA1298Crs1801131MTHFRC677Trs1801133MTRRA66Grs1801394PROCC169Trs757583846VEGFA
‑
1154G/Ars1570360PROSA586Grs121918474SERPINC1C218Trs121909551
THBDG1209Trs398122807。
[0014]作为本专利技术的血栓形成导致复发流产风险基因的改进：11个基因的12个位点对应的引物如下：
[0015][0016][0017]wt表示野生型，mt表示突变型。
[0018]本专利技术还同时提供了一种血栓形成导致复发流产风险基因的评估模型，利用如上所述的基因，所特定的赋值表如下：
dNTP；其余为去离子水；
[0039]PCR扩增程序：95℃，2分钟
‑
>(94℃，30秒；60℃，60秒；72℃，60秒；30个循环)
‑
>7本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.血栓形成导致复发流产风险基因，其特征在于：根据基因权重，设定的基因名称和对应的位点、rs编号如下：基因名称位点rs编号F2G20210Ars1799963F5G1691Ars6025IL10c.
‑
149+2211A>Grs1800871PAI
‑1‑
675 4G/5Grs1799768MTHFRA1298Crs1801131MTHFRC677Trs1801133MTRRA66Grs1801394PROCC169Trs757583846VEGFA
‑
1154G/Ars1570360PROSA586Grs121918474SERPINC1C218Trs121909551THBDG1209Trs398122807。2.根据权利要求1所述的血栓形成导致复发流产风险基因，其特征在于：11个基因的12个位点对应的引物如下：
wt表示野生型，mt表示突变型。3.血栓形成导致复发流产风险基因的评估模型，其特征在于：利用如权利要求1或2所述的基因，所特定的赋值表如下：基因名称rs编号杂合型纯合突变型纯合野生型F2rs17999632.870F5rs60254.111.40IL10rs1800871
‑
0.5
‑
0.50PAI
‑
1rs179976846.40MTHFRrs18011312.22.80MTHFRrs18011332.12.50MTRRrs180139401.40PROCrs757583846590VEGFArs1570360330PROSrs121918474550SERPINC1rs1219095513.550THBDrs3981228072.140用于RSA风险值的计算公式为：2
×
{2.8
×
rs1799963+3
×
rs6025+(3+rs1570360+rs121918474+rs121909551+rs398122807)
×
(1+rs1799768)+[(1+rs1801131)
×
(1+rs1801133)+1]^(2
rs1801394
)+2
×
rs757583846}
×3rs1800871
；判断阈值为60～65。4.根据权利要求3所述的血栓形成导致复发流产风...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪旭涛，李星秀，黄文，
申请(专利权)人：夷希微医学科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：