间充质基质细胞作为IPSC诱导的重编程来源制造技术

提供了间充质基质细胞作为ipsc诱导的重编程来源。特别是，提供了产生诱导间充质基质细胞(iMSC)的方法、由该方法产生的iMSC及其用途。途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】间充质基质细胞作为IPSC诱导的重编程来源


[0001]本专利技术属于干细胞技术，具体涉及由诱导多能干细胞(iPSC)产生诱导间充质基质细胞(iMSC)的方法、由该方法产生的iMSC及其用途。
[0002]专利技术背景
[0003]间充质干/基质细胞是多能细胞。其于1924年被首次发现并描述为间充质内的单一类型的前体细胞[3]，并且其骨髓细胞的克隆性质揭示于1960年代[4]。一种离体测定，即集落形成单位成纤维细胞(CFU
‑
F)，建立于1968年以检查这些多能骨髓细胞的克隆形成潜力[5]。尽管最初认为MSC是骨髓中的造血支持细胞，但后来揭示了其自我更新和分化为多种细胞类型(包括脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞)的能力[6，7]。同种异体移植的MSC由于其免疫抑制潜力可以规避免疫排斥[8]。并且MSC分泌的细胞因子和趋化因子显示了免疫调节功能[9]。因此，MSC通过细胞的直接注射或其条件培养基的间接应用流行于细胞疗法中[7，10，11]。截至目前，已经启动了200多项临床试验，但MSC疗法仍处于安全性测试阶段[12]。原代MSC临床应用的两个主要障碍是所培养细胞的异质性及其受限的离体增殖能力。永生化MSC和iPSC衍生的MSC为原代MSC提供了有吸引力的替代方案。与原代MSC相比，它们具有无限或显著更高的离体增殖能力，因此可以大量用于临床应用[13，14]。
[0004]诱导多能干细胞(iPSC)可以由不同的细胞类型如成纤维细胞和外周血单核细胞(PBMC)重编程而来。细胞来源可能会影响人iPSC的谱系分化倾向[1，2]。iPSC最早由Shinya Yamanaka开发，他通过转导4个转录因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc)于2006年重编程小鼠成体成纤维细胞，并于2007年重编程人成体成纤维细胞[15，16]。iPSC被认为是具有与胚胎干细胞相似的干性的多能细胞。本专利技术通过解决人胚胎干细胞的伦理限制，开创了干细胞应用的新纪元。现有许多不同的方法来递送重编程因子，可以概括为3种策略[17]：非病毒、整合病毒和非整合病毒重编程方法。非病毒重编程方法包括mRNA转染[18]、miRNA感染/转染[19
‑
21]、piggyBac转染[22]、小环载体[23]和游离质粒[24]。非病毒方法可防止病毒整合到宿主基因组中从而增加致瘤性的风险。然而，大多数非病毒方法的效率低于0.05％[17]。具有更高效率的慢病毒载体广泛用于感染非分裂和增殖细胞。但这种方法的主要问题是慢病毒载体序列会整合到iPSC基因组中。随后开发了非整合病毒载体例如仙台病毒载体，以避免基因组整合。虽然需要大约10代的病毒去除步骤，但基于仙台病毒的重编程具有最高的效率，对于成纤维细胞可以达到1％，对于血细胞可以达到0.1％。
[0005]通过这些转导方法，iPSC能够由各种细胞类型衍生，包括成纤维细胞[15，16]、外周血单核细胞(PBMC)[25，26]、皮肤活检样本[27]、间质基质细胞(MSC)[28]、来自单簇毛发的角质形成细胞[29]和尿液中的肾上皮细胞[30
‑
32]。iPSC也已被诱导成间MSC(iMSC)[14，33，34]，但iMSC的免疫调节功能在一些报道中相互矛盾[35
‑
37]。iMSC已被认为是未来细胞疗法的方便、高效和商业化的来源[38，39]。然而，尚未对衍生自不同来源的iPSC的iMSC进行系统比较。
[0006]专利技术详述
[0007]在本公开中，使用具有Yamanaka转录因子的仙台病毒产生iPSC。使用不同的来源，
对iPSC的能力(包括识别特定标志物、胚胎形成、畸胎瘤形成和谱系分化)进行了评估。与其他来源相比，MSC衍生的iPSC在分化为iMSC方面显示出优势，这由表面标志物鉴定和RNA
‑
seq的基因表达谱证实。根据释放的细胞因子的比较，这些iMSC在体外和体内也保持与原代MSC相似的生物免疫调节功能。生成了稳定的hMSC衍生的iPSC细胞系，并建立了离体功能性iMSC的有效扩增方法。
[0008]在第一方面，本公开提供了用于产生诱导间充质基质细胞(iMSC)的方法，包括：
[0009]在第一培养基下培养诱导多能干细胞(iPSC)第一预定时间段；
[0010]用第二培养基替换所述第一培养基并在所述第二培养基下培养所述细胞第二预定时间段；
[0011]胰蛋白酶消化所述培养的细胞；
[0012]在第三培养基下将胰蛋白酶消化的细胞接种在包被或未包被的组织培养物上第三预定时间段；和
[0013]用第四培养基替换所述第三培养基，并将所述接种的细胞培养第四预定时间段。
[0014]在一些实施方案中，iPSC通过重编程人原代间充质基质细胞(MSC)产生。
[0015]在一些实施方案中，第一培养基可以包含：
[0016]敲除血清；和
[0017]TGFβ和ALK抑制剂。
[0018]在一些实施方案中，第二培养基可以包含：
[0019]Dulbecco
’
s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F
‑
12(DMEM/F12)；
[0020]TGFβ和ALK抑制剂；和
[0021]敲除血清或胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒(ITS
‑
G)溶液。
[0022]在一些实施方案中，第三培养基可以包含：
[0023]DMEM/F12；
[0024]敲除血清；和
[0025]碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。
[0026]在一些实施方案中，第四培养基可以包含DMEM
‑
LG培养基并且任选地补充有FBS。
[0027]在第二方面，本公开提供了通过iPSC的分化产生诱导间充质基质细胞(iMSC)的方法，其中iPSC通过重编程间充质基质细胞(iMSC)产生。
[0028]在第三方面，本公开提供了通过iPSC的分化产生诱导间充质基质细胞(iMSC)的方法，其中iPSC通过重新编程间充质基质细胞(iMSC)产生。
[0029]在本公开的第二方面和第三方面的一些实施方案中，用于生成iPSC的MSC是原代MSC，例如人原代MSC。
[0030]在第四方面，本公开提供了用于产生或诱导诱导间充质基质细胞(iMSC)的培养基，其包含：
[0031]Dulbecco
’
s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F
‑
12(DMEM/F12)；
[0032]敲除血清；和
[0033]TGFβ和ALK抑制剂。
[0034]在一些实施方案中，培养基进一步包含：
[0035]细胞因子；和
[0036]表皮生长因子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于产生诱导间充质基质细胞(iMSC)的方法，所述方法包括：在第一培养基下培养诱导多能干细胞(iPSC)第一预定时间段；用第二培养基替换所述第一培养基并在所述第二培养基下培养所述细胞第二预定时间段；胰蛋白酶消化培养的细胞；在第三培养基下将胰蛋白酶消化的细胞接种在包被或未包被的组织培养物上第三预定时间段；和用第四培养基替换所述第三培养基，并将接种的细胞培养第四预定时间段。2.权利要求1的方法，其中所述iPSC是通过重编程人原代间充质基质细胞(MSC)产生的。3.权利要求1或2的方法，其中所述第一培养基包含：敲除血清；和TGFβ和ALK抑制剂。4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述第二培养基包含：Dulbecco
’
s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F
‑
12(DMEM/F12)；TGFβ和ALK抑制剂；和敲除血清或胰岛素
‑
转铁蛋白
‑
硒(ITS
‑
G)溶液。5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述第三培养基包含：DMEM/F12；敲除血清；和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)。6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述第四培养基包含DMEM
‑
LG培养基并且任选地补充有FBS。7.用于产生诱导间充质...

【专利技术属性】
技术研发人员：C陈，KR博赫勒，J沈，邓瑞霞，HY罗，
申请(专利权)人：香港大学，
类型：发明
国别省市：