一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，特别涉及一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法。本发明专利技术的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其通过对人类脐带间充质干细胞进行低氧培养处理的相关工艺和质量控制标准进行明确，低氧处理结果显著增加了细胞存活期，显著提高了间充质干细胞中VEGF分泌水平，延长了细胞进入机体后可发挥效用作用的时间，进一步达到改善治疗效果的作用。效果的作用。效果的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法


[0001]本专利技术涉及生物医药
，特别涉及一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是起源于生物体早期中胚层的一类多能干细胞，它们具有自我复制和向多种细胞系（向成脂、成软骨、成骨等）分化的潜能，是组织工程、再生医学和细胞治疗领域一种具有极高研究价值与应用前景的细胞类型。MSCs来源广泛，主要包括骨髓、脐带、脐带血、胎盘、外周血、牙髓、脂肪组织、肝脏和肺等，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord
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derived mesenchymal stem cells，hUC
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MSCs）因为具有低免疫原性、易分离获取、少伦理争议等优点，在MSCs的研究中得到的应用越来越多。
[0003]研究表明间充质干细胞具有免疫调节功能，间充质干细胞可以分泌许多生物分子和介质，如细胞因子、外泌体等，这些分泌物质在细胞的免疫调节功能的发挥中起着重要作用，此外，MSCs可以抑制促炎细胞因子的分泌，可以调节树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞的细胞因子分泌，同时，其分泌的细胞因子可以诱导巨噬细胞向抗炎细胞的转变；MSCs具有较低的免疫原性，因为间充质干细胞缺乏细胞表面的HLA
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DR和共同刺激分子抗原，如CD40、CD80和CD86等；以上特性赋予了MSCs在疾病中的许多治疗益处 ，如今，MSCs对病理性肺纤维化、脑缺血、急性肾功能衰竭、心肌梗死、急性肺损伤和阿尔茨海默病等等都有很好的治疗效果。
[0004]临床方面脐带间充质干细胞已经广泛应用于联合造血干细胞移植、自身免疫性疾病治疗、心血管疾病治疗、神经系统疾病治疗及缺血性疾病治疗。脐带间充质干细胞治疗已经从基础研究、动物实验逐步跨进了临床转化阶段，很多I、II期的研究也取得了鼓舞人心的成果，hUC
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MSCs移植为许多疾病的治疗带来了希望，可以降低病死率，提高患者的生活质量。然而hUC
‑
MSCs移植作为一项生物医学领域新技术，还不可避免面临许多问题比如：1、如何进一步确定hUC
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MSCs的培养及鉴定标准；2.如何建立严格规范统一的hUC
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MSCs质检标准；3.如何对hUC
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MSCs的生物学功能稳定性和移植进入人体后的存活期进行加强。随着研究的深入，更多机理研究的数据在不断得到积累，通过对间充质干细胞进行低氧预处理后再移植在一些文献中有相关报道，但是，现有文献对于低氧处理的方式只做了笼统概述，低氧处理工艺细节性描述不详，低氧后的可用于移植细胞的质量控制标准不明确。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术的问题，本专利技术提供了一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其通过对人类脐带间充质干细胞进行低氧培养处理的相关工艺和质量控制标准进行明确，低氧处理结果显著增加了细胞存活期，显著提高了间充质干细胞中VEGF分泌水平，延长了细胞进入机体后可发挥效用作用的时间，进一步达到改善治疗效果的作用。
[0006]本专利技术所采用的技术方案如下：一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：A、将20%氧浓度条件下培养的P3代间充质干细胞收集后用培养基重悬；B、传代培养至细胞汇合度达到60
‑
70%时，将细胞转移至10%
‑
1%氧浓度的低氧氧浓度条件下进行三阶段培养；C、待细胞达到细胞汇合度达到90%后，使用溶媒收集细胞；D、进行细胞因子检测，因子分泌浓度达到VEGF因子浓度高于1000pg/mL浓度的标准，即得到低氧型的间充质干细胞。
[0007]优选的，间充质干细胞的培养体系为无血清体系，无动物源成分。
[0008]优选的，间充质干细胞为人类脐带来源。
[0009]优选的，步骤A中，P3代间充质干细胞使用间充质干细胞培养体系进行重悬，吹打混匀，调整细胞终浓度为1
×
105个/mL
±1×
104个/mL。
[0010]优选的，步骤B中，传代培养的细胞接种浓度为2
×
104个/cm2±1×
103个/cm
2 。
[0011]优选的，步骤B中，低氧处理的方法具体为阶段性低氧处理，分为低氧阶段一：氧浓度为10%，处理时间2h；低氧阶段二：氧浓度为5%，处理时间4h；低氧阶段三：氧浓度为1%，培养至细胞可收集终点。
[0012]优选的，步骤C 中，收集细胞所用溶媒为0.9%生理盐水与人血清白蛋白组成，其中，人血清白蛋白所占体积分数为1%。
[0013]优选的，收获的间充质干细胞，其活率达到90%以上，细胞表型检测CD45，CD34，HLA DR 为阴性，CD73，CD90，CD105为阳性且满足90%以上表达。
[0014]优选的，最终收获的细胞需进行细菌、真菌、内毒素、支原体、病毒项检测，并符合阴性结果。
[0015]本专利技术提供的技术方案带来的有益效果是：通过本专利技术的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法所收获的低氧培养型脐带间充质干细胞在细胞活率、细胞存活性能上显著提高，且细胞因子分泌水平显著提升，细胞移植后能更好地适应不同组织部位的低氧条件并发挥显著性治疗效果。
附图说明
[0016]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]图1为通过本专利技术的方法培养得到的低氧培养型脐带间充质干细胞的细胞存活数量比对图，包括低氧培养型脐带间充质干细胞（hypoxia
‑
MSC）数量，常规培养方法（normal
‑
MSC）的脐带间充质干细胞数量；图2为通过本专利技术的方法培养得到的低氧培养型脐带间充质干细胞的细胞活率比对图，包括低氧培养型脐带间充质干细胞活率和常规培养方法的脐带间充质干细胞活率；图3为不同批次低氧间充质干细胞的VEGF因子分泌水平示意图；图4为低氧型间充质干细胞表型鉴定示意图；
图5为不同氧浓度下细胞VEGF因子分泌水平示意图；图6为不同氧处理工艺下细胞功能性评价指标示意图。
具体实施方式
[0018]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。
[0019]实施例1：首先，本实施例提供一种常规脐带间充质干细胞的培养方法，其包括以下过程：（1）复苏冻存的P3代脐带间充质干细胞，在T75培养瓶中，使用间充质干细胞培养体系，于5% CO2、37℃条件下进行培养至细胞汇合度达到100%；（2）在培养瓶中加入2mL 胰酶，轻轻晃动培养瓶使酶液完全铺展于培养瓶底，将培养瓶置于37℃进行消化5min；（3）本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：A、将20%氧浓度条件下培养的P3代间充质干细胞收集后用培养基重悬；B、传代培养至细胞汇合度达到60
‑
70%时，将细胞转移至10%
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1%氧浓度的低氧氧浓度条件下进行三阶段培养；C、待细胞达到细胞汇合度达到90%后，使用溶媒收集细胞；D、进行细胞因子检测，因子分泌浓度达到VEGF因子浓度高于1000pg/mL浓度的标准，即得到低氧型的间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述的间充质干细胞的培养体系为无血清体系，无动物源成分。3.根据权利要求1所述的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述间充质干细胞为人类脐带来源。4.根据权利要求1所述的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤A中，P3代间充质干细胞使用间充质干细胞培养体系进行重悬，吹打混匀，调整细胞终浓度为1
×
105个/mL
±1×
104个/mL。5.根据权利要求1所述的一种低氧型脐带间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述步...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学娟，孙旭燕，高宗圣，
申请(专利权)人：山东省齐鲁干细胞工程有限公司，
类型：发明
国别省市：