一种无乳链球菌菌株ΔessC及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种essC基因敲除的无乳链球菌菌株ΔessC及其构建方法和应用，所述essC基因序列如SEQIDNO.1所示，或为与SEQIDNO.1完全互补配对的序列，或为如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。经研究发现essC基因缺失造成了分泌免疫原性胞外蛋白ESAT6产生分泌障碍，从而降低了无乳链球菌株毒性。同时，本发明专利技术所构建的无乳链球菌基因敲除菌株ΔessC与野生株生长速率基本一致，且具有明显减毒特征，本研究对无乳链球菌

【技术实现步骤摘要】
一种无乳链球菌菌株
Δ
essC及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及属于生物
，更具体地，本专利技术涉及一种无乳链球菌菌株ΔessC及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)属于B族链球菌(GBS)，具有广泛的宿主范围，能感染人类、哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼类等宿主，对全球公共卫生和人体健康造成了很大的危害。我国属罗非鱼养殖大国，属链球菌病高流行地区，其发病率和死亡率为罗非鱼传染病之首，疫情呈三高特征(发病率高、死亡率高、耐药率高)，形成全国性的防治压力。
[0003]近年来研究发现，在放线杆菌门和厚壁菌门等革兰氏阳性细菌中，存在一种新型分泌系统，即
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型分泌系统(Type 7 secretion system,T7SS)。
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型分泌系统由多种组分构成，分泌两种免疫原性胞外蛋白，ESAT6和CFP
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10，与菌株毒力密切相关。无乳链球菌研究显示，ESAT6蛋白以同源二聚体形式发挥作用。
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型分泌系统单个基因各自编码具有特定功能的蛋白质，决定着ESAT6/CFP10及其毒力蛋白分泌转运，并与细菌的毒力和发病机制存在重要的联系,因此对
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型分泌系统的研究有助于了解无乳链球菌毒力蛋白分泌机制，有助于阐明无乳链球菌的生存、增值和扩散的分子基础，更是为寻找抗无乳链球菌基因蛋白药物的作用靶点提供关键性线索，进而为从根本上控制无乳链球菌病提供可能性。

技术实现思路

[0004]基于此，本专利技术的目的之一在于提供一个essC基因及蛋白在无乳链球菌毒性调控中的应用，经研究发现无乳链球菌中的essC基因缺失造成了分泌免疫原性胞外蛋白ESAT6产生分泌障碍，从而降低了菌株毒性。
[0005]实现上述目的的技术方案如下：
[0006]一种essC基因在无乳链球菌毒性调控中的应用，所述essC基因序列如SEQ ID NO.1所示，或为与SEQ ID NO.1完全互补配对的序列，或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0007]一种essC蛋白在无乳链球菌毒性调控中的应用，所述essC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。
[0008]在其中一些实施例中，所述毒性表现为分泌免疫原性胞外蛋白，优选为分泌ESAT6蛋白。
[0009]在其中一些实施例中，所述毒性调控为正向调控，优选为essC基因敲除下调无乳链球菌ESAT6蛋白表达。
[0010]本专利技术的目的之一还在于提供一种essC基因重组敲除载体，其特征在于，所述重
组载体上插入以氯霉素抗性基因CAT代替essC基因的融合片段，所述融合片段由上述essC基因的上、下游片段和CAT基因片段组成。
[0011]在其中一些实施例中，所述essC基因上游片段为其上游632bp同源臂，所述essC基因下游片段为其下游571bp同源臂。
[0012]本专利技术的目的之一还在于提供一种essC基因重组敲除载体的构建方法。
[0013]实现上述目的的技术方案如下：
[0014](1)以无乳链球菌基因组DNA为模板，以SEQ ID NO.3
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SEQ ID NO.4为引物对PCR扩增essC基因上游片段essCup，以SEQ ID NO.5
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SEQ ID NO.6为引物对PCR扩增essC基因下游片段essCdown；以质粒pSET5S为模板，以SEQ ID NO.7
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SEQ ID NO.8为引物对PCR扩增氯霉素抗性基因片段CAT；
[0015](2)将步骤(1)得到的三个片段经纯化后进行融合PCR扩增；
[0016](3)将步骤(2)得到的融合PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3
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SEQ ID NO.6为引物对进行PCR扩增验证；
[0017](4)将步骤(3)验证得到的融合酶切后连接至线性化载体pSET4s，连接产物转化后经鉴定，筛选，即得。
[0018]本专利技术的目的之一还在于提供一种essC基因重组敲除载体在调控无乳链球菌毒性中的应用。
[0019]在其中一些实施例中，所述毒性调控为essC基因敲除下调无乳链球菌ESAT6蛋白表达。
[0020]本专利技术的目的之一还在于提供一种essC基因敲除的无乳链球菌菌株ΔessC。
[0021]实现上述目的的具体技术方案如下：
[0022]一种essC基因敲除的无乳链球菌菌株ΔessC，所述ΔessC为无乳链球菌中的essC基因存在缺失，缺失的essC基因序列如SEQ ID NO.1所示，或为与SEQ ID NO.1完全互补配对的序列，或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0024]本专利技术的专利技术人在无乳链球菌中发现一个影响其
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型分泌系统重要的膜蛋白essC，经研究发现essC基因缺失造成了分泌免疫原性胞外蛋白ESAT6产生分泌障碍，从而降低了无乳链球菌株毒性。同时，本专利技术所构建的essC基因敲除的无乳链球菌菌株ΔessC与无乳链球菌野生株生长速率基本一致，且具有明显减毒特征，本研究对无乳链球菌
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型分泌系统的研究提供了理论基础，为寻找抗无乳链球菌基因蛋白药物的作用靶点提供关键性线索。
附图说明
[0025]图1为实施例1中essC同源臂融合PCR结果图。
[0026]图2为实施例1中敲除株ΔessC DNA水平PCR鉴定结果图。
[0027]图3为实施例1中敲除株ΔessC RNA水平PCR鉴定结果图。
[0028]图4为实施例2中敲除株ΔessC生长曲线测定结果图。
[0029]图5为实施例2中敲除株ΔessC与野生株毒力试验结果图。
[0030]图6为实施例3中敲除株ΔessC与野生株的ESAT6基因qPCR检测结果，其中a为扩增效率分析结果图；b为溶解曲线分析结果图；c为扩增产物琼脂糖凝胶检测结果图。
[0031]图7为实施例3中敲除株ΔessC与野生株对底物蛋白ESAT6表达量的影响结果。
具体实施方式
[0032]为了便于理解本专利技术，下面将参照实施例对本专利技术进行更全面的描述，以下给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种essC基因在无乳链球菌毒性调控中的应用，其特征在于，所述essC基因序列如SEQ ID NO.1所示，或为与SEQ ID NO.1完全互补配对的序列，或为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列，或为编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。2.一种essC蛋白在无乳链球菌毒性调控中的应用，其特征在于，所述essC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，或如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。3.根据权利要求1
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2中任一项所述应用，其特征在于，所述毒性表现为分泌免疫原性胞外蛋白，优选为分泌ESAT6蛋白。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述毒性调控为正向调控，优选为essC基因敲除下调无乳链球菌ESAT6蛋白表达。5.一种essC基因重组敲除载体，其特征在于，所述重组载体上插入以氯霉素抗性基因CAT代替essC基因的融合片段，所述融合片段由如权利要求1所示essC基因的上、下游片段和CAT基因片段组成。6.根据权利要求5所述重组敲除载体，其特征在于，所述essC基因上游片段为其上游632bp同源臂，所述essC基因下游片段为其下游571bp同源臂。7.一种essC基因重组敲除载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(...

【专利技术属性】
技术研发人员：马艳平，刘振兴，吴梓鋆，郝乐，马江耀，梁志凌，柯浩，
申请(专利权)人：广东顺安丰泰水产科技有限公司，
类型：发明
国别省市：