一种基于二重荧光定量PCR鉴定毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于二重荧光定量PCR鉴定毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数的方法，广泛适用于以P

【技术实现步骤摘要】
Mixture、TaKaRa Ex Taq和ddH2O。
[0010]优选的，所述10
×
Ex Taq Buffer中含有20mM Mg
2+
。
[0011]优选的，检测P
AOX1
启动子基因的上游引物Pf、下游引物Pr的终浓度均为120nM，Taqman探针PT的终浓度为240nM；检测β
‑
actin内参基因的上游引物βf、下游引物βr的终浓度均为120nM，Taqman探针βT的终浓度为240nM。
[0012]优选的，所述二重荧光定量PCR体系的体积为25μL，包括：10
×
Ex Taq Buffer 3.8μL，dNTP Mixture 2μL，上游引物Pf、下游引物Pr、上游引物βf、下游引物βr各0.3μL，Taqman探针PT、Taqman探针βT各0.6μL，TaKaRa Ex Taq 0.2μL，基因组模板5μL，ddH2O 11.6μL。
[0013]本专利技术的第二方面，提供一种基于二重荧光定量PCR鉴定毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数的方法，包括以下步骤：
[0014](1)分别以毕赤酵母空白菌株基因组DNA和转化重组载体后的毕赤酵母基因组DNA为模板，构建针对P
AOX1
启动子基因和β
‑
actin内参基因的二重荧光定量PCR体系进行D
‑
qPCR分析；
[0015](2)根据如下公式对毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数进行计算：
[0016][0017][0018]或利用以下估算公式：
[0019][0020][0021]其中，Copies
(Mut+)
为转化后Mut
+
型菌株中目的基因拷贝数；Copies
(Muts)
为转化后Mut
s
型菌株中目的基因拷贝数；E
X
为P
AOX1
基因的扩增效率；E
R
为β
‑
actin内参基因的扩增效率；C
qXcal
为以空白菌株基因组为模板进行D
‑
qPCR后，P
AOX1
基因的Cq值；C
qRcal
为以空白菌株基因组为模板进行D
‑
qPCR后，内参基因的Cq值；C
qXtest
为以转化后菌株基因组为模板进行D
‑
qPCR后，P
AOX1
基因的Cq值；C
qRtest
为以转化后菌株基因组为模板进行D
‑
qPCR后，内参基因的Cq值。
[0022]优选的，步骤(1)中针对P
AOX1
启动子基因和β
‑
actin内参基因的二重荧光定量PCR体系为25μL，包括：10
×
Ex Taq Buffer 3.8μL，dNTP Mixture 2μL，上游引物Pf、下游引物Pr、上游引物βf、下游引物βr各0.3μL，Taqman探针PT、Taqman探针βT各0.6μL，TaKaRa Ex Taq 0.2μL，基因组模板5μL，ddH2O 11.6μL；
[0023]上游引物Pf、下游引物Pr和Taqman探针PT，其序列分别如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.3所示；上游引物βf、下游引物βr和Taqman探针βT，其序列分别如SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.6所示。
[0024]优选的，步骤(1)中，D
‑
qPCR分析的反应条件为：预变性95℃180s；变性95℃15s，退火50℃30s，延伸72℃15s，循环30次。
[0025]本专利技术的有益效果：
[0026](1)P
AOX1
基因和β
‑
actin内参基因的扩增反应虽然在同一PCR管中进行，引物和探针之间几乎不会产生交叉干扰，且6FAM和ROX基团的发光波长相距很远，几乎没有重叠，光信号也不会发生交叉干扰。
[0027](2)如P
AOX1
基因和β
‑
actin内参基因分开PCR，则可能带来一系列操作误差，在同一PCR管反应则可避免加样等操作带来的误差。
[0028](3)不需要知道基因组的浓度，对基因组的纯度也没有很高要求。
[0029](4)本专利技术与传统染料法qPCR相比，探针的存在使其精密度更高。与传统探针法qPCR相比，测量精密度与其不相上下，但会节约1倍试剂成本。
[0030](5)由于反应在同一PCR管中进行，本专利技术可同时检测样本的数目比任何一种传统qPCR高1倍，即筛选效率可以提高1倍。
附图说明
[0031]图1：外源基因插入Mut+型毕赤酵母的示意图。
[0032]图2：外源基因插入Muts型毕赤酵母的示意图。
[0033]图3：qPCR的原理示意图。
[0034]图4：P
AOX1
基因的D
‑
qPCR标准曲线(空白对照组基因组DNA稀释1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64六个浓度梯度)。
[0035]图5：β
‑
actin内参基因的D
‑
qPCR标准曲线(空白对照组基因组DNA稀释1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64六个浓度梯度)。
[0036]图6：空白菌株P
AOX1
基因及β
‑
actin内参基因的单重及二重qPCR的信号强度及Cq值。
具体实施方式
[0037]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0038]正如
技术介绍
部分所介绍的，qPCR常被用于毕赤酵母中目的基因拷贝数的测定。目前几乎所有的测定方法都是染料法qPCR，把P
AOX1
基因和内参基因分开进行PCR。这样做可能会带来操作误差，而且染料法的重复性较差。此外，需进行2次PCR反应，浪费试剂且操作较繁琐，效率低下。
[0039]基于此，本专利技术的目的是提供一种高效的、相对低成本的、准确度高的测定毕赤酵母中目的基因拷贝数的方法。
[0040]通过qPCR计算酵母中目的基因拷贝数与多重qPCR是两个不同的研究领域。做酵母表达基本都要对目的基因拷贝数进行测试，但目前几乎所有文献都是用单重PCR，还未见有利用多重PCR的报道。这主要是因为多重PCR检测目的基因的表达水平，与计算拷贝数不同，不涉及绝对定量，因此很少有用多重PCR来研究酵母表达体系的，所以在以往二者几乎没有交集。本专利技术重点围绕酵母表达体系，为基因组中目的基因拷本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.针对P
AOX1
启动子基因和β
‑
actin内参基因的二重荧光定量PCR体系在鉴定毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数中的应用；所述二重荧光定量PCR体系包括：检测P
AOX1
启动子基因的上游引物Pf、下游引物Pr和Taqman探针PT，其序列分别如SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO.3所示；检测β
‑
actin内参基因的上游引物βf、下游引物βr和Taqman探针βT，其序列分别如SEQ ID NO.4
‑
SEQ ID NO.6所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述二重荧光定量PCR体系还包括：10
×
Ex Taq Buffer、dNTP Mixture、TaKaRa Ex Taq和ddH2O。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述10
×
Ex Taq Buffer中含有20mM Mg
2+
。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测P
AOX1
启动子基因的上游引物Pf、下游引物Pr的终浓度均为120nM，Taqman探针PT的终浓度为240nM；检测β
‑
actin内参基因的上游引物βf、下游引物βr的终浓度均为120nM，Taqman探针βT的终浓度为240nM。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的应用，其特征在于，所述二重荧光定量PCR体系的体积为25μL，包括：10
×
Ex Taq Buffer 3.8μL，dNTP Mixture 2μL，上游引物Pf、下游引物Pr、上游引物βf、下游引物βr各0.3μL，Taqman探针PT、Taqman探针βT各0.6μL，TaK aRa Ex Taq 0.2μL，基因组模板5μL，ddH2O 11.6μL。6.一种基于二重荧光定量PCR鉴定毕赤酵母表达体系中目的基因拷贝数的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)分别以毕赤酵母空白菌株基因组DNA和转化重组载体后的毕赤酵母基因组DNA为模板，构建针对P
AOX1
启动子基因和β
‑
actin内参基因的二重荧光定量PCR体系进行D
‑
qPCR分析；(2)根据如下公式对毕赤酵母表达体系中目的基因拷...

【专利技术属性】
技术研发人员：高玉舟，李海超，乔善鹏，刘珍妮，
申请(专利权)人：长春国科医工科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：