云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物及方法技术

本发明专利技术公开了云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物及方法，属于基因工程技术领域。所述扩增引物包括如SEQ ID NO.1

【技术实现步骤摘要】
云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物及方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物及方法。

技术介绍

[0002]云南牛蛭Hirudinidea Poecilobdella，属于颚蛭目(Gnathobdellida)，医蛭科(Hirudidae)，牛蛭属(Hirudinaria Whitman)。云南牛蛭为无脊椎软体动物，无骨架结构，全体均可以利用；主要成分是蛋白质、多肽、微量元素和脂肪酸素等。在内陆淡水水域内生长繁殖，是我国传统的特种药用水生动物，其干制品炮制后中医入药，具有治疗中风、高血压、清淤、闭经、跌打损伤等功效。
[0003]云南具有丰富的蛭类资源，在全国发现的相关物种中，云南蛭类占中国已知蛭类1/3以上，云南一些特有种为其它地方所罕见。近些年新发现水蛭制剂在防治心脑血管疾病和抗癌方面具有特效，因此该物种可为药用研究和物种鉴定、进化遗传学及系统演化研究提供一定的基础资料和技术支持。线粒体基因组是生物重要的遗传物质，其中后生动物线粒体DNA为典型的环状分子结构，长度大多在14
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18kb之间，编码37个基因，包括13个蛋白质基因，22个tRNA以及12S rRNA和16S rRNA。线粒体DNA是核外遗传物质，具有分子量小、结构简单、母系遗传等特点，成为生物多样性、群体遗传学与系统进化研究中的重要分子标记。鉴于目前该科类群遗传学尤其是线粒体基因组方面的信息量比较少，开展其线粒体基因组全序列的研究就显得十分必要。
[0004]目前扩增线粒体基因组全序列的方法大多采用引物步移法，通过对公共数据库中近缘物种线粒体基因组中保守区设计引物，对目标区域扩增序列并测序,对测序得到的序列再继续设计引物进行扩增测序，重复这一步骤直到测序得到的全部序列经拼接后获得完整线粒体基因组序列位置。以往的引物扩增反应后产物长度较短(400
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500bp)，按照线粒体基因组大小15000bp计算，需要设计30对以上的引物来完成全部片段的扩增和有效拼接，费时费力，且反复扩增测序导致错误率升高，影响测序后的拼接结果和注释准确性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物及方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过筛选得到14对特异性引物，并用于扩增云南牛蛭线粒体全基因序列，这为云南牛蛭的药用研究、物种鉴定、进化遗传学及系统演化研究提供一定的基础资料和技术支持。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了如下方案：
[0007]本专利技术提供一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物，包括如下14对对引物对：
[0008](1)第1对引物为如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；(2)第2对引物为如SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；(3)第3对
引物为如SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；(4)第4对引物为如SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；(5)第5对引物为如SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物；(6)第6对引物为如SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；(7)第7对引物为如SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物；(8)第8对引物为如SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物；(9)第9对引物为如SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物；(10)第10对引物为如SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物；(11)第11对引物为如SEQ ID NO.21所示的上游引物和SEQ ID NO.22所示的下游引物；(12)第12对引物为如SEQ ID NO.23所示的上游引物和SEQ ID NO.24所示的下游引物；(13)第13对引物为如SEQ ID NO.25所示的上游引物和SEQ ID NO.26所示的下游引物；(14)第14对引物为如SEQ ID NO.27所示的上游引物和SEQ ID NO.28所示的下游引物。
[0009]本专利技术还提供所述的扩增引物在云南牛蛭线粒体全基因组序列扩增中的应用。
[0010]本专利技术还提供一种利用所述的扩增引物扩增云南牛蛭线粒体全基因组序列的方法，包括以提取的云南牛蛭基因组DNA为模板，利用所述的扩增引物进行PCR扩增，所得扩增产物进行琼脂糖电泳检测、测序。
[0011]优选的是，扩增反应体系包括：DNA模板60ng、0.2
‑
1.0μM引物各1.5μL，2.5mM dNTP 8μL、10
×
PCR Buffer 5μL、2.0mM MgCl
2 1μL、Tap酶0.5μL，余量用无核酸酶水补齐50μL。
[0012]优选的是，扩增程序为：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共35个循环，最后72℃延伸10min。
[0013]优选的是，所述扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。
[0014]本专利技术还提供一种扩增云南牛蛭线粒体全基因组序列的试剂盒，包括所述的扩增引物。
[0015]本专利技术公开了以下技术效果：
[0016](1)本专利技术针对云南地区的云南牛蛭设计了14对特异性引物，可以对云南牛蛭线粒体DNA进行PCR扩增，并获得线粒体全长基因。本专利技术的扩增体系可以用更少的引物来完成目的片段的全覆盖，减少了扩增工作量，同时也降低了多次扩增反应造成的扩增错误的概率。
[0017](2)牛蛭基因组目前可用的参考基因组较少，扩增方法每一对引物的反应条件都会有所不同，因此，对于这个类群生物的线粒体基因组的获得会非常有意义，该物种可为药用研究和物种鉴定、进化遗传学及系统演化研究提供一定的基础资料和技术支持.
[0018](3)本专利技术首次获得云南牛蛭线粒体基因组全长序列，经分析得出：序列全长14667bp，包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因。
附图说明
[0019]图1表示云南牛蛭8对特异性引物的电泳图(DL2000 Plus DNA Marker)；
[0020]图2表示云南牛蛭6对特异性引物的电泳图(DL5000 DNA Marker)。
具体实施方式
[0021]现详细说明本专利技术的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本专利技术的限制，而应理解为是对本专利技术的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0022]应理解本专利技术中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本专利技术。另外，对于本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种云南牛蛭线粒体全基因组序列的扩增引物，其特征在于，包括如下14对对引物对：(1)第1对引物为如SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物；(2)第2对引物为如SEQ ID NO.3所示的上游引物和SEQ ID NO.4所示的下游引物；(3)第3对引物为如SEQ ID NO.5所示的上游引物和SEQ ID NO.6所示的下游引物；(4)第4对引物为如SEQ ID NO.7所示的上游引物和SEQ ID NO.8所示的下游引物；(5)第5对引物为如SEQ ID NO.9所示的上游引物和SEQ ID NO.10所示的下游引物；(6)第6对引物为如SEQ ID NO.11所示的上游引物和SEQ ID NO.12所示的下游引物；(7)第7对引物为如SEQ ID NO.13所示的上游引物和SEQ ID NO.14所示的下游引物；(8)第8对引物为如SEQ ID NO.15所示的上游引物和SEQ ID NO.16所示的下游引物；(9)第9对引物为如SEQ ID NO.17所示的上游引物和SEQ ID NO.18所示的下游引物；(10)第10对引物为如SEQ ID NO.19所示的上游引物和SEQ ID NO.20所示的下游引物；(11)第11对引物为如SEQ ID NO.21所示的上游引物和SEQ ID NO.22所示的下游引物；(12)第12对引物为如SEQ ID NO.23所示的上...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟凡明，罗艺菲，刘子超，张磊，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：