一种重组工程菌及其构建方法和其应用技术

本发明专利技术涉及一种重组工程菌及其构建方法和其应用，所述重组工程菌经诱导后高效表达L

【技术实现步骤摘要】
一种重组工程菌及其构建方法和其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种重组工程菌及其构建方法和其应用。

技术介绍

[0002]D
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泛解酸内酯为用于合成维生素类药D
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泛醇及神经营养药D
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高泛酸钙的医药中间体，并用作饲料添加剂和日化产品的合成前体，年产量超过上万吨。
[0003]常采用化学合成法制备DL
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泛解酸内酯，再将制得的DL
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泛解酸内酯转化为D
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泛解酸内酯。微生物酶法拆分DL
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泛解酸内酯获得D
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泛解酸内酯包括下述步骤：1)微生物酶选择性水解DL
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泛解酸内酯中的D
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泛解酸内酯或者L
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泛解酸内酯，得到L
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泛解酸内酯和D
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泛解酸或L
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泛解酸和D
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泛解酸内酯；2)利用有机试剂萃取混合液，实现L
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泛解酸内酯和D
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泛解酸的分离；3)D
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泛解酸经过内酯化处理，得到D
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泛解酸内酯，L
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泛解酸内酯经过化学消旋重新变成DL
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泛解酸内酯，再拆分。该方法存在下述缺陷：一是拆分步骤多，分离效率低；二是化学消旋过程会产生大量色素和其它杂质，拆分制得的D
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泛解酸内酯颜色较深，外观品质较差；三是化学消旋会产生大量硫酸盐，形成固体废弃物，造成环境污染。
[0004]CN110423717A公开了一种多酶重组细胞及多酶级联催化合成D
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泛解酸内酯的方法，该方法通过重组细胞表达L
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泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶和葡萄糖脱氢酶，来转化D,L
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泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯、并进而生成D
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泛解酸内酯。该方法存在下述缺陷：L
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泛解酸内酯脱氢酶对L
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泛解酸内酯及其催化反应的选择性差，其既催化L
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泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯，也催化D
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泛解酸内酯生成酮泛解酸内酯，L
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泛解酸内酯和D
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泛解酸内酯同时竞争结合L
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泛解酸内酯脱氢酶的活性位点，D
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泛解酸内酯会陷入循环反应，由此导致酶活力降低；当底物中L
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泛解酸内酯含量较低时，无法和L
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泛解酸内酯脱氢酶有效接触，难以完全转化，由此导致制得的产物中会含有L
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泛解酸内酯而增加纯化难度，且产品质量难以保证。
[0005]为此，如何开发高选择性且利于提高D
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泛解酸内酯的纯度和质量、反应效率和资源利用率等重组载体及其工程菌成为本领域迫切需要解决的方面。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种重组载体，所述重组载体含有L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D
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泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的重组载体。
[0007]本专利技术的优选技术方案中，L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D
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泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4分别在第一重组载体、第二重组载体、第三重组载体和第四重组载体上。
[0008]本专利技术的优选技术方案中，所述重组载体任选地包括第五重组载体或第六重组载体的任一种，其中，第五重组载体包含L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示和酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第六重组载体包含L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D
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泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0009]本专利技术优选的技术方案中，所述重组载体用于DL
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泛解酸内酯制备D
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泛解酸内酯。
[0010]本专利技术优选的技术方案中，所述L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因源自红串红球菌、红球菌、分支杆菌、诺卡氏菌、链霉菌、放线菌中的任一种。
[0011]本专利技术优选的技术方案中，所述L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到L
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泛解酸内酯脱氢酶基因序列。
[0012]本专利技术优选的技术方案中，酶切位点选自XhoI、NdeI的任一种或其组合。
[0013]本专利技术优选的技术方案中，所述L
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泛解酸内酯脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因1，所述目的基因1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0014]本专利技术优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因源自木兰假丝酵母、小单孢菌、链霉菌中的任一种。
[0015]本专利技术优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到酮泛解酸内酯还原酶基因序列。
[0016]本专利技术优选的技术方案中，酶切位点选自SacI、NotI的任一种或其组合。
[0017]本专利技术优选的技术方案中，所述酮泛解酸内酯还原酶基因序列经人工合成制得目的基因2，所述目的基因2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0018]本专利技术优选的技术方案，所述甲酸脱氢酶编码基因源自伯克霍尔德菌、大肠杆菌、气单胞菌中的任一种。
[0019]本专利技术优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶编码基因经过密码子优化并加上酶切位点得到甲酸脱氢酶基因序列。
[0020]本专利技术优选的技术方案中，酶切位点选自XhoI、NdeI的任一种或其组合。
[0021]本专利技术优选的技术方案中，所述甲酸脱氢酶基因序列经人工合成制得目的基因3，所述目的基因3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0022]本专利技术优选的技术方案中，所述D
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泛解酸内酯水解酶编码基因源自串珠镰孢霉菌、腐皮镰孢菌、镰刀霉菌中的任一种。
[0023]本专利技术优选的技术方案中，所述D
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组载体，所述重组载体含有L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D
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泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列如SEQID NO.4所示的重组载体。2.根据权利要求1所述的重组载体，其中，所述重组载体任选地包括第五重组载体或第六重组载体的任一种，其中，第五重组载体包含L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示和酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第六重组载体包含L
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泛解酸内酯脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、酮泛解酸内酯还原酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示、甲酸脱氢酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和D
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泛解酸内酯水解酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。3.一种重组工程菌，所述重组工程菌包括能够表达L
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泛解酸内酯脱氢酶的第一重组载体、表达酮泛解酸内酯还原酶的第二重组载体、表达甲酸脱氢酶的第三重组载体和表达D
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泛解酸内酯水解酶的第四重组载体的任一种或其组合；和/或，所述重组工程菌包括能够共表达L
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泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶的第五重组载体；和/或，所述重组工程菌包括能够共表达L
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泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶、甲酸脱氢酶编码基因和D
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泛解酸内酯水解酶的第六重组载体。4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其中，所述重组工程菌包含能够共表达L
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泛解酸内酯脱氢酶、酮泛解酸内酯还原酶的第五重组载体和表达甲酸脱氢酶的第三重组载体；优选的，所述重组工程菌中还包含表达D
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泛解酸内酯水解酶的第四重组载体，或者与表达D
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泛解酸内酯水解酶的第四重组载体的第二重组工程菌联合使用。5.一种重组工程菌的构建方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：周芳芳，刘树蓬，刘磊，张大伟，余军，
申请(专利权)人：巴彦淖尔华恒生物科技有限公司秦皇岛华恒生物工程有限公司合肥华恒生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：