机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法技术

机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，包括利用已有的人角膜内皮种子细胞，以及机械强度增强后的去上皮层羊膜载体支架，通过添加专用培养体系，将人角膜内皮种子细胞悬液接种到机械增强型去上皮层羊膜载体支架上，即构建出机械性能、组织结构和功能与正常角膜内皮相近的组织工程角膜内皮。本发明专利技术攻克了传统组织工程角膜内皮机械性能不足无法应用于DMEK术式的难题，同时构建出的组织工程角膜内皮具有角膜内皮细胞密度极高、连接紧密的单层内皮结构（高达3500~3800个细胞/mm2，相当于0~3岁儿童的角膜内皮细胞密度），且移植到刮除角膜内皮的家猫及猕猴眼中可使动物角膜长期维持透明，重建出可以行使正常功能的角膜内皮。重建出可以行使正常功能的角膜内皮。

【技术实现步骤摘要】
机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法


[0001]本专利技术涉及一种机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，属于再生医学组织工程领域的构建技术。

技术介绍

[0002]角膜位于眼球最前端的无血管透明组织，为眼睛提供大部分屈光力，也是人体唯一的免疫赦免区。角膜的组织结构由外到内依次为角膜上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层。其中角膜内皮层由单层、扁平、连接紧密的六角形内皮样细胞镶嵌而成，对维持角膜的半脱水状态、正常厚度、透明性以及从房水中获取养分与氧气具有无法替代的作用。人角膜内皮细胞在成年后丧失了分裂能力，且以每年0.3%~0.6%的比例死亡。局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞的增大、扩展和移行来填补缺损区，以维持角膜内皮层的单层形态和功能。此外，白内障等手术损伤、长期高眼压（青光眼）、持续重度虹膜炎和严重虹膜前粘连等均可引起大量角膜内皮细胞的损伤与快速死亡，一旦角膜内皮细胞密度低于维持内皮生理功能的临界密度(600~800个/平方毫米)，角膜将出现不可逆病变，最终将引起角膜内皮失代偿，轻者引起角膜水肿和视敏度下降，重者甚至致盲。角膜内皮病盲患者绝大部分可以通过角膜移植而复明，但由于捐献角膜的数量有限和老化问题，致使大量患者因得不到移植角膜而无法复明。近年来，角膜组织工程的兴起与发展为组织工程角膜内皮的体外构建及其临床应用创造了条件，也为角膜内皮病盲患者通过组织工程角膜内皮的移植重见光明带来了新的希望，因而如何获得正常足量的人角膜内皮种子细胞，制备出具有一定机械强度及良好生物相容性的载体支架，建立高密度内皮的体外构建方式，进而可以利用临床中供体内皮移植的最佳术式——后弹力层角膜内皮移植术（DMEK）进行移植治疗，仍然是当前组织工程角膜内皮体外构建研究的热点和难点。
[0003]在种子细胞方面，樊廷俊等在国际上成功建立了非转染无致瘤性的人角膜内皮组织细胞系（ZL200510044143.3），首次解决了组织工程角膜内皮规模化构建所需大量种子细胞的来源问题。
[0004]在载体支架方面，目前用于组织工程角膜体外构建所用的载体支架主要有角膜后弹力层、去上皮羊膜、胶原
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壳聚糖
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硫酸软骨素共混膜、胶原
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壳聚糖
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透明质酸钠、聚羟乙基丙烯酸甲酯、脱细胞猪角膜基质和N
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(1
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甲基乙基)
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丙烯酰胺均聚物等。其中，樊廷俊等利用新鲜羊膜在体外制备了具有良好生物相容性的组织工程人角膜内皮载体支架（ZL201010102340.7），成功解决了组织工程角膜内皮体外构建缺失载体支架的难题。然而该羊膜支架虽然与人角膜内皮种子细胞具有良好的生物相容性，但基于该支架构建的组织工程人角膜内皮机械强度不够，无法应用于对支架硬度有要求的临床角膜内皮移植的DMEK术式；同时，如何获得具有更高密度的组织工程人角膜内皮，依然是目前限制组织工程人角膜内皮规模化生产的瓶颈。因此，如何筛选和制备具有高仿生、机械性强、透明性好、能定向调控细胞行为的理想载体支架，仍然是制约组织工程角膜内皮规模化体外构建的瓶颈问题。
[0005]因此，建立理想载体支架的制备技术，进而建立机械性能理想且功能性好的组织工程人角膜内皮的体外构建技术，生产出可用于临床DMEK术式移植的组织工程人角膜内皮，对于彻底解决供体角膜材料的严重匮乏问题以及有效治疗该类疾病至关重要要。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，利用人角膜内皮组织细胞和机械增强型去上皮层羊膜载体支架进行组织工程角膜内皮的体外构建，以弥补现有技术和材料的不足。
[0007]本专利技术的技术构思是利用已有的人角膜内皮种子细胞，以及机械强度增强后的去上皮层羊膜载体支架，通过添加专用培养体系，将特定数量的人角膜内皮种子细胞悬液接种到机械增强型去上皮层羊膜载体支架上，即构建出机械性能、组织结构和功能与正常角膜内皮相近的组织工程角膜内皮。
[0008]一种机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）角膜内皮种子细胞的制备：取人角膜内皮细胞，利用含10%~20%（v/v）胎牛血清的DMEM/F12培养液对人角膜内皮细胞进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，再加入0.25%（w/v）胰蛋白酶
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0.02%（w/v）EDTA混合溶液消化，离心收集细胞沉淀，再用专用培养液A将该细胞沉淀悬浮成人角膜内皮细胞悬液；2）载体支架的制备：利用0.25%（w/v）胰蛋白酶对新鲜羊膜的上皮面进行倒置消化以制备完全去上皮层羊膜，利用细胞刮刀刮除松散的上皮细胞，利用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟后，将去上皮层羊膜避光浸泡在专用交联剂溶液B中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理 20~40 分钟后，利用波长320~420 nm的紫外光照射10~20分钟，照射距离为3~6厘米进行机械性能改性；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次15~20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15~20分钟；将交联漂洗后的去上皮层羊膜上皮层朝上平铺于PVDF膜上，风干24~48小时；利用角膜环钻将该去上皮层羊膜从PVDF膜上环成与培养板孔直径相同的圆片；继而使用剂量为7~14kGy的电离射线进行辐照灭菌，即制成组织工程角膜内皮的载体支架；3）组织工程人角膜内皮的体外构建：将载体支架上皮面朝上平铺于48孔培养板孔的底部，将上述人角膜内皮细胞悬液1毫升接种在平铺有上述羊膜载体支架的培养板中，置于37℃、5%（v/v）二氧化碳培养箱中12小时，待人角膜内皮细胞全部贴附在上述羊膜载体支架上后，吸出专用培养液A，然后在上述48孔培养板中加入1mL专用培养液C，置于37℃、5%二氧化碳培养箱中进行培养，然后每隔12~24小时更换构建专用培养液C一次，持续培养96~120小时后，待人角膜内皮细胞在羊膜载体支架上长成单层即为构建的组织工程人角膜内皮。
[0009]所述组织工程人角膜内皮构建专用培养液A的配方为含有10%胎牛血清、0.02~0.04毫克/毫升Y
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27632的DMEM/F12培养液。
[0010]所述组织工程人角膜内皮构建专用交联剂溶液B的配方：含有50
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100毫克/毫升右旋糖苷、1~2毫克/毫升维生素B2的生理盐水。
[0011]所述组织工程人角膜内皮构建专用培养液C的配方：含有10%胎牛血清、0.05~0.15
毫克/毫升纤连蛋白和0.005~0.015毫克/毫升层粘连蛋白的DMEM/F12培养液。
[0012]所述步骤1）用专用培养液A将该细胞沉淀悬浮成人角膜内皮细胞悬液中，人角膜内皮细胞的浓度为3
×
105~5
×
105个细胞/毫升。
[0013]所述步骤1）中的离心收集细胞沉淀，是1000~1500转/分离心10~15分钟获得人角膜内皮细胞沉淀。
[0014]所述步骤2）中所用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种机械增强型组织工程角膜内皮的体外构建方法，其特征在于包括以下步骤：1）角膜内皮种子细胞悬液的制备：取人角膜内皮细胞，利用含10%~20%（v/v）胎牛血清的DMEM/F12培养液对人角膜内皮细胞进行扩增培养，待细胞长满单层后，吸出培养液，再加入0.25%（w/v）胰蛋白酶
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0.02%（w/v）EDTA混合溶液消化，离心收集细胞沉淀，再用专用培养液A将该细胞沉淀悬浮成人角膜内皮细胞悬液；2）载体支架的制备：利用0.25%（w/v）胰蛋白酶对新鲜羊膜的上皮面进行倒置消化以制备完全去上皮层羊膜，利用细胞刮刀刮除松散的上皮细胞，利用漂洗缓冲液漂洗2次，每次15~20分钟后，将去上皮层羊膜避光浸泡在专用交联剂溶液B中，于37℃恒温摇床缓慢摇动浸泡处理 20~40 分钟后，利用波长320~420 nm的紫外光照射10~20分钟，照射距离为3~6厘米进行机械性能改性；之后用0.9%（w/v）生理盐水漂洗2次，每次15~20分钟后，再用超纯水漂洗2次，每次15~20分钟；将交联漂洗后的去上皮层羊膜上皮层朝上平铺于PVDF膜上，风干24~48小时；利用角膜环钻将该去上皮层羊膜从PVDF膜上环成与培养板孔直径相同的圆片；继而使用剂量为7~14kGy的电离射线进行辐照灭菌，即制成组织工程角膜内皮的载体支架；3）组织工程人角膜内皮的体外构建：将载体支架上皮面朝上平铺于48孔培养板孔的底部，将上述人角膜内皮细胞悬液1毫升接种在平铺有上述羊膜载体支架的培养板中，置于37℃、5%（v/v）二氧化碳培养箱中12小时，待人角膜内皮细胞全部贴附在上述羊膜载体支架上后，吸出专用培养液A，然后在上述48孔培养板中加入1mL专用培养液C，置...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊廷俊，赵君，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：