一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法，涉及显微组织切片技术领域，配置10ml固定剂(75％OCT+25％无菌水)待用，准备高压灭菌镊子、刀片、无RNA酶的离心管、培养皿、包埋盒，选择长势良好的大白菜植株，将外叶切除，保留中间部分，包含长度约0.5cm的幼叶及叶原基包裹的顶端分生组织；将根部切除，保留下部2mm左右的胚轴，将此部分白菜组织浸泡在装有10ml 75％OCT的离心管中，置于冰上，抽真空10min以固定组织。本发明专利技术解决了现有技术因固定液含有乙醇导致的植物组织活性丧失的问题，同时克服了白菜组织含水量大，易形成冰晶，难以保持组织结构完整的问题，保证了样品中RNA不被降解，为大白菜茎尖组织结构观察及后续相关转录组学研究提供了强有力的保障。关转录组学研究提供了强有力的保障。关转录组学研究提供了强有力的保障。

【技术实现步骤摘要】
一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法


[0001]本专利技术涉及显微组织切片
，尤其涉及一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法。

技术介绍

[0002]大白菜属于十字花科芸苔属植物，原分布于中国华北地区，现于中国各地区广泛栽培。大白菜主要以结球叶片做为食用器官，叶球营养丰富，既可作炒食也可生食、腌制，亦可作家禽家畜的饲料，同时还有药用价值。大白菜茎尖组织结构复杂，包含顶端分生组织、叶原基、幼叶等，是研究大白菜叶片发育及叶球形成的关键部位。因此，制备茎尖组织细胞结构完整、RNA等大分子保存完好的切片，将为观察茎尖细胞结构，开展后续分子生物学研究，改良作物分子遗传，提供良好基础。
[0003]常见的植物组织切片方法包括徒手切片法，但该方法制作出的切片较为粗糙，厚度不均，容易损伤植物组织；其次有石蜡切片法，该方法操作步骤复杂繁琐、制作周期长，容易对植物组织材料造成损伤，染色过程涉及脱蜡入水、抗原修复等较为复杂繁琐。而冷冻切片不同于以上两种方法，较之徒手切片，它的成片质量更高，较之石蜡切片，它的制作步骤更加简单、易操作，制作周期更短，而且能够减少对植物组织的损伤，保持植物细胞的抗原活力和酶活，适合对新鲜植物组织的制片。但是，不同的制片方法制作出的植物组织冷冻切片的成片效果各不相同制备方法存在差异。现有的冷冻切片制作过程中所采用的固定液多为酒精、二甲苯一类的有机溶剂制作而成，容易造成植物组织抗原活性和各种酶活性的丧失，且大白菜组织冰冻时组织内水份多，容易形成冰晶，造成组织破碎，成片不完整，因此为了更好地保证白菜组织结构的完整，亟需一种能完整表现白菜组织结构的切片的方法来改变这一现状。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法。其优点在于解决了现有技术因固定液含有乙醇导致的植物组织活性丧失的问题，同时克服了白菜组织含水量大，易形成冰晶，难以保持组织结构完整的问题，保证了RNA不被降解，为白菜组织结构研究及后续高通量转录组学等分子实验提供了强有力的保障。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
[0006]一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一：配置10ml固定剂(75％OCT+25％无菌水)待用，准备高压灭菌镊子、刀片、无RNA酶的离心管、培养皿、包埋盒；
[0008]步骤二：选择长势良好的大白菜植株：将外叶切除，保留中间部分，包含长度约0.5cm的幼叶及叶原基包裹的顶端分生组织；将根部切除，保留下部2mm左右的胚轴，将此部分白菜组织浸泡在装有10ml75％OCT的离心管中，置于冰上，抽真空10min以固定组织；
[0009]步骤三：取一次性培养皿，向培养皿中放入5
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10ml的100％OCT包埋剂备用。用镊子将固定后的大白菜茎尖组织小心地从离心管中取出，放入培养皿中包裹一层100％OCT。在白菜组织被OCT完全包裹后，使用镊子等尖锐物品将白菜组织周围的气泡挑出，室温下静置5min。将100％OCT包埋剂覆盖包埋盒底层，用镊子轻轻将培养皿中的白菜组织取出，缓慢放入底层覆盖了包埋剂的包埋盒后，再次向包埋盒中加入100％OCT包埋剂，覆盖白菜组织，调整样品在包埋盒中位置后，然后去除包埋剂中样品周围的气泡，室温下静置1h。然后，调整组织在包埋盒中的位置，并再次察看样品周围气泡情况，并将其挑出。将调整好的包埋盒放置于干冰粉上凝固，待OCT由透明转变为完全不透明的白色后取出包埋盒并作好样品信息标记；
[0010]步骤四：调试冷冻切片机，固定切片使用的刀片，使用100％OCT将样品包埋块固定在样品托上。然后，将固定在样品托上的白菜组织与刀片平行方向放置，调整好样品与刀片之间的距离，设定切片厚度为20um,开始切片。切片时，切片速度选择“慢切”，将切下的切片吸附在粘附性载玻片上并标记好样品信息。注意：切片应置于切片机内，使其保持低温冷冻状态，减少切片样品的失水，等待后续操作；
[0011]步骤五：样品切片制备完成后，将从切片机中取出，置于室温条件下，待载玻片上的样品切片由白色转为透明时，使用显微镜进行观察，并拍照记录下样品切片图像。
[0012]本专利技术进一步设置为，所述固定剂由7.5ml的lO0％OCT和2.5ml的蒸馏水配制而成。使用75％的OCT试剂作为包埋剂，处理白菜样品，避免常规固定剂对样品组织活性的伤害。
[0013]本专利技术进一步设置为，在将样品放入包埋盒之前，使用100％OCT先对样品进行包裹，减少后续包埋过程中气泡进入样品的机率。在后续过程中，及时将白菜组织周围的气泡挑出，并尤其注意茎尖分生组织部位的气泡需要仔细挑出。
[0014]本专利技术进一步设置为，先使用100％OCT包埋剂覆盖包埋盒底层(尽量不要产生气泡)，可防止样品在包埋后裸露在冷冻模块外，并且对包埋盒做好标记，以便分清方向。
[0015]本专利技术进一步设置为，在使用OCT包埋剂时，将包埋剂瓶身平放，一次性将所有包埋盒底部都覆盖上OCT，防止包埋剂瓶身反复挤压，减少包埋剂瓶中的气泡，从而减少包埋盒中的气泡。
[0016]本专利技术进一步设置为，在样品托上涂上100％OCT时，通过增加切面面积，将更有利于样品切割，获得完成的样品切片。
[0017]本专利技术进一步设置为，切下来的样品切片吸附在粘附性载玻片上时，应注意载玻片不能过冷，否则会影响样品吸附性。
[0018]本专利技术的有益效果为：
[0019]本专利技术制备的白菜组织冷冻切片操作流程简单、制作周期短，切出的成片厚度均匀、结构清晰，采用75％OCT真空的方法对白菜组织进行固定，解决了现有技术因固定液含有乙醇导致的植物组织活性丧失的问题，同时克服了白菜组织含水量大，易形成冰晶，难以保持组织结构完整的问题，保证了RNA不被降解，为白菜组织结构研究及后续高通量转录组学等分子实验提供了强有力的保障。
附图说明
[0020]图1为本专利技术提出的一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法的制备流程结构示意图；
[0021]图2为本专利技术提出的一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法的选取的白菜苗结构示意图；
[0022]图3为本专利技术提出的一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法的包裹在包埋盒中的白菜组织放置正面和侧面示意图；
[0023]图4为本专利技术提出的一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法的吸附在载玻片上的白菜组织冷冻切片结构示意图；
[0024]图5为本专利技术实施例1提出的一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法的白菜组织切片显微图像结构示意图；
[0025]图6为本专利技术实施例1中提出的一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法的白菜组织中RNA质量检测结果。经过本方法固定、包埋的组织样品中可提取高质量的RNA。
具体实施方式
[0026]下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0027]下面详细描述本专利的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大白菜茎尖冷冻切片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：固定液制备和材料准备配置10ml固定剂(75％OCT+25％无菌水)待用，准备高压灭菌镊子、刀片、无RNA酶的离心管、培养皿、包埋盒；步骤二：取材固定选择长势良好的大白菜植株：将外叶切除，保留中间部分，包含长度约0.5cm的幼叶及叶原基包裹的顶端分生组织；将根部切除，保留下部2mm左右的胚轴，将此部分白菜组织浸泡在装有10ml 75％OCT的离心管中，置于冰上，抽真空10min以固定组织；步骤三：包埋取一次性培养皿，向培养皿中放入5
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10ml的100％OCT包埋剂备用。用镊子将固定后的大白菜茎尖组织小心地从离心管中取出，放入培养皿中包裹一层100％OCT。在白菜组织被OCT完全包裹后，使用镊子等尖锐物品将白菜组织周围的气泡挑出，室温下静置5min。将100％OCT包埋剂覆盖包埋盒底层，用镊子轻轻将培养皿中的白菜组织取出，缓慢放入底层覆盖了包埋剂的包埋盒后，再次向包埋盒中加入100％OCT包埋剂，覆盖白菜组织，调整样品在包埋盒中位置后，然后去除包埋剂中样品周围的气泡，室温下静置1h。然后，调整组织在包埋盒中的位置，并再次察看样品周围气泡情况，并将其挑出。将调整好的包埋盒放置于干冰粉上凝固，待OCT由透明转变为完全不透明的白色后取出包埋盒并作好样品信息标记；步骤四：切片调试冷冻切片机，固定切片使用的刀片，使用100％OCT将样品包埋块固定在样品托上。然后，将固定在样品托上的白菜组织与刀片平行方向放置，调整好样品与刀片之间的距离，设定切片厚度为20um,开始切片。切片...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵建军，孙晓雪，曾雨凡，马卫，申书兴，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：