硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法技术

本发明专利技术公开了一种硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法。所述方法采用硅胶柱层析法，以24～28:24～28:24～28:10～12:9～14的二氯甲烷

【技术实现步骤摘要】
硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法


[0001]本专利技术涉及一种硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法，属于分离纯化


技术介绍

[0002]磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)的主链是甘油，其sn
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3位羟基易被磷酸酯化形成磷脂酸，磷脂酸的磷酸羟基再被胆碱代替，成为PC。鞘磷脂(sphingomyelin,SM)的结构与PC相似，但其主链是长链氨基醇鞘氨醇。PC和SM均是乙酰胆碱最基本的合成源，大脑中的各个细胞则通过乙酰胆碱来传递信息。补充外源性PC和SM即增加乙酰胆碱可使神经细胞信息传递速度加快，从而提高记忆力，具有强大功效。并且这两者为婴儿提供了近17％的生长所必需的营养物质胆碱，是维持婴儿快速发育及合成体内生物膜必不可少的物质。因此，PC和SM被普遍认为是磷脂中最具价值的营养物质。在医药领域中，这两者可作为脂质体的乳化剂，递送活性组分，增加药效，同时提高了脂肪和胆固醇在血液中的溶解度，改善脂肪的吸收和降低体内胆固醇含量，有效地防治动脉粥样硬化引起的心脑血管疾病。由此可见，PC和SM在食品、化工、医药等领域应用前景广阔。
[0003]目前对提取SM的研究仍处于初级阶段，主要有普通溶剂分级法、薄层色谱法、高效液相色谱法等。中国专利申请CN110294774A公开了一种富含鞘磷脂的脂质的制备方法，该方法采用普通溶剂分级法，利用特定的乳品种类、溶剂温度、乳品与提取剂比例，提高鞘磷脂在脂质中的富集效果，但得到的SM纯度低，仅38.29％。中国专利申请CN102099453B通过不断利用溶剂分级且使用了磷脂酶最终获得了纯度高于90％的SM，但由于磷脂酶价格昂贵，不适合用于工业生产。薄层色谱法和高效液相色谱法虽然均可获得纯度高的SM，但两者的处理量均不大，且薄层色谱法需要对分离后的SM进行刮板提取，后续处理较繁琐，液相设备也因其维护费用高不宜用于大量制备(姚云平.乳脂肪球的组成结构,体外消化及抗菌特性[D].江南大学,2017.)。另外，对于PC的制备方法已有大量文献报道。中国专利申请CN102633832B通过醇处理、氧化铝柱层析乙醇洗脱和硅胶柱层析乙醇梯度洗脱制备了纯度高达90～100％的PC，但是该方法需经历两种填料的柱层析洗脱，较繁琐且增加了成本。中国专利申请CN104558020B经过硅胶柱层析两次洗脱得到纯度为98～99.9％的PC，但是其所用原料是PC>72％的蛋黄卵磷脂，成本较高，具有局限性，不适用于工业生产。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法，该方法工艺简单、成本较低，且能够同时得到高纯磷脂酰胆碱和鞘磷脂，既高效又充分利用了原料，且对原料的选择广泛，适合工业化生产。
[0005]实现本专利技术目的的技术方案如下：
[0006]硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法，包括以下步骤：
[0007]按硅胶与粗磷脂的重量比为150:1～300:1，以硅胶为柱层析固定相，用第一个洗
脱剂溶解粗磷脂，上样，依次利用第一个洗脱剂和第二个洗脱剂进行梯度洗脱，用自动部分收集器收集流出液，期间通过薄层层析色谱(TLC)实时监测，其中梯度洗脱的具体方法为：先通过第一个洗脱剂洗脱出非SM部分，从中合并相同的含单一的PC斑点流份，再通过第二个洗脱剂快速洗脱SM部分，合并相同的含单一的SM斑点流份，第一个洗脱剂为体积比24～28:24～28:24～28:10～12:9～14的二氯甲烷
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异丙醇
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乙酸甲酯
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甲醇
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水体系，第二个洗脱剂为体积比5:5:1～1.55的二氯甲烷
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甲醇
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水体系；最后分别对合并的PC斑点流份和SM斑点流份浓缩干燥，分别得到高纯PC和高纯SM。
[0008]优选地，粗磷脂的提取来源主要为富含PC和/或SM的物质，例如磷脂富集物、乳制品(动物乳、酪乳粉、黄油、乳清等)、植物油料(大豆、菜籽、葵花籽等)、蛋黄等。
[0009]优选地，柱层析所用硅胶为200～300目，装填硅胶径高比为1:5～1:8。
[0010]优选地，粗磷脂与第一个洗脱剂的质量体积比为1g：25～40mL。
[0011]优选地，上样后，使粗磷脂溶液上液面降至硅胶填料上界面，使粗磷脂与硅胶充分吸附30min～60min。
[0012]优选地，梯度洗脱具体步骤为：先用第一个洗脱剂洗脱3～3.8倍柱体积，从中合并相同的含单一的PC斑点流份，再用第二个洗脱剂洗脱1.2～1.6倍柱体积，合并相同的含单一的SM斑点流份。
[0013]优选地，TLC实时监测条件为：薄层板固定相为硅胶，展开剂为第一个洗脱剂体系，显色剂为碘蒸汽。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：
[0015]本专利技术采用硅胶柱层析法，以特定比例范围的两种洗脱剂体系进行两次洗脱，同时制备了纯度在95.0～99.9％的PC和纯度在85.0～95.0％的SM，该方法步骤简单、成本低、能耗低、效率高，对原料的选择不受限，适用于不同提取来源的粗磷脂。
附图说明
[0016]图1为实施例1中柱层析洗脱部分PC和SM的TLC图，其中SM：鞘磷脂，PC：磷脂酰胆碱，PS：磷脂酰丝氨酸，PI：磷脂酰肌醇，PE：磷脂酰乙醇胺，SULPH：硫脂，FFA：游离脂肪酸，TAG：甘油三酯。
[0017]图2为实施例1(A)、实施例2(B)和对比例1(C)、对比例2(D)、对比例3(E)、对比例4(F)的柱层析洗脱过程的TLC定性结果示意图。
[0018]图3为实施例1中所得PC和SM的
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P
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NMR图。
具体实施方式
[0019]下面结合具体实施例和附图对本专利技术做进一步详细描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对本专利技术权利要求的限制。
[0020]下述实施例中的粗磷脂采用现有方法制备，参考文献【A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues】和【The Effect of Cold Acetone Fractionation on the Total Phospholipid Valoe and the Lecithin/Sphingomyelin Ratio of Amniotic Fluid】，具体步骤如下：原料中加入20倍体积的二氯甲烷:甲醇(2:1，v/v)超声提取30min，然后4000r/min离心10min，收集有机相，在
其中加入1/4体积食盐水(NaCl 1％，w/w)涡旋2min，再通过3000r/min离心5min加速相分离过程，收集下层二氯甲烷相，35℃旋蒸得总脂。在总脂中加入冷丙酮，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.硅胶柱层析同时分离纯化磷脂酰胆碱和鞘磷脂的方法，其特征在于，包括以下步骤：按硅胶与粗磷脂的重量比为150:1～300:1，以硅胶为柱层析固定相，用第一个洗脱剂溶解粗磷脂，上样，依次利用第一个洗脱剂和第二个洗脱剂进行梯度洗脱，用自动部分收集器收集流出液，期间通过薄层层析色谱实时监测，其中梯度洗脱的具体方法为：先通过第一个洗脱剂洗脱出非鞘磷脂部分，从中合并相同的含单一的磷脂酰胆碱斑点流份，再通过第二个洗脱剂快速洗脱鞘磷脂部分，合并相同的含单一的鞘磷脂斑点流份，第一个洗脱剂为体积比24～28:24～28:24～28:10～12:9～14的二氯甲烷
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异丙醇
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乙酸甲酯
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甲醇
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水体系，第二个洗脱剂为体积比5:5:1～1.55的二氯甲烷
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甲醇
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水体系；最后分别对合并的磷脂酰胆碱斑点流份和鞘磷脂斑点流份浓缩干燥，分别得到高纯磷脂酰胆碱和高纯鞘磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁丽，刘雨，刘国艳，徐鑫，朱俊龙，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：