一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，属于生物工程技术领域，所述试剂盒主要包括裂解结合液、纳米磁珠、洗涤液；本发明专利技术试剂盒采用多层夹心的羧基修饰PEG纳米磁珠，可无需洗脱而实现带磁珠扩增。特殊的裂解结合液与洗涤液成份，可针对性地获得cfDNA，而无需单独去除基因组DNA。该试剂盒无需使用乙醇、异丙醇等成份。该试剂盒可手工操作，亦可在市面现有核酸自动提取仪上进行自动化操作，而无需定制特殊耗材，具有操作步骤简单、cfDNA得率高、敏感性好、运输方便的特点。尤其是利用本发明专利技术试剂盒及试剂盒提供的操作方法，可简单快速得到能够直接用于产前诊断的cfDNA样本，提高产前诊断的效率和灵敏性。前诊断的效率和灵敏性。前诊断的效率和灵敏性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒。

技术介绍

[0002]血液中游离的DNA简称cfDNA（circulating free DNA），是指循环血液中的核酸类物质，包括循环血液中细胞内的核酸，游离的内源性脱氧核糖核酸和外源性DNA与RNA。血液中cfDNA在疾病的早期诊断、预后、监测等方面具有重要潜在价值。在特定的生理条件或疾病过程中，有相当一部分cfDNA会与在健康的时候不同，基于这一结果，近年来cfDNA已被用于无创性诊断。在孕妇中，约有10%
‑
15%的cfDNA来自于胎盘滋养层，现在cfDNA多用于在高危孕妇中筛查胎儿的遗传缺陷，这就是是当前火热的无创唐氏筛查的基础！在肿瘤病人中，通过cfDNA的量化突变来检测肿瘤已被越来越多的人认可。而在移植方面，移植排斥反应也与供体移植器官中的cfDNA水平相关。
[0003]cfDNA是人体细胞排放到血液里的DNA片段，这些DNA的量很少，片段也很短，长度在170bp上下。现有技术中对cfDNA的提取存在以下难点和缺陷：由于cfDNA含量很低，提取难度较大，提取效率低，在产前诊断中导致未检出率较高，这限制了cfDNA作为一种常规检测手段的应用和发展；采用常规传统的提取方法提取得到的DNA为全基因组DNA，包含人类基因组中所有的DNA片段，在后续检测中会产生较大且复杂的背景噪音；传统的提取方法，提取步骤多、耗时长，并需要用到多种易燃的化学试剂，如乙醇、异丙醇等。

技术实现思路

[0004]为提高cfDNA的提取效率，本专利技术的目的一在于提供一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒。目的二在于提供利用所述提取试剂盒进行用于产前诊断的cfDNA的提取方法；目的三在于所述提取试剂盒在制备产前诊断药物中的应用。
[0005]所述试剂盒具有操作步骤简单、cfDNA得率高、敏感性好、运输方便的特点。利用本专利技术试剂盒及试剂盒提供的操作方法，可简单快速完成cfDNA检测的样本预处理工作。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的具体方案如下：一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，包含裂解结合液、纳米磁珠、洗涤液、洗脱液；所述裂解结合液的pH值为5.7～7.9，包括1.2～4.8M的琥珀酸二异辛酯磺酸钠、1.5～2.6mM的异硫氰酸胍、2.3～3.8mM的盐酸胍、1.3～3.4mM的SDS、1%～3.6%的 MES和10%～20%的PEG；所述纳米磁珠为以聚苯乙烯为核心，纳米四氧化三铁为夹心，以二氧化硅或纤维素为包覆，并用PEG包裹，然后进行羧基化修饰的纳米磁性颗粒；所述纳米磁珠为多层夹心结构，直径为400～2000nm，浓度为30～80mg/ml；所述洗涤液包括80～160mM十六烷基三甲基溴化铵、pH值为7.5～8.5的20～38mM Tris
‑
Hcl、5%～9%的ASEA和10～50mM的FMES；
所述洗脱液的pH不低于8.0，包括EDTA和Tris
‑
Hcl。
[0007]作为对上述提取试剂盒的进一步优化，所述裂解结合液中选用的PEG分子量大于2000。
[0008]作为对上述提取试剂盒的进一步优化，所述纳米磁珠通过以下方法进行制备：a:选取粒径在400～700nm的聚苯乙烯微球100g，分散在1L的无水乙醇溶液中；b:加入按物质的量比为3:2配置的4mol/L的 Fe
3+
与Fe
2+
的混合盐溶液400ml，通入惰性气体除氧30min，调整体系温度为60～65℃，加入氨水至体系PH值为10，反应2h，加入50ml按体积3:2预混的油酸与月桂酸混合物，继续反应30min，然后迅速冷却至30℃，磁分离后，用50%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，然后分散在800ml无水乙醇中；c:加入正硅酸四乙酯和氨水200ml或羧甲基纤维素与氨水260ml，反应1h，然后磁分离并用30%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，最后分散在800ml30%乙醇溶液中；d:加入20%的PEG6000溶液200ml，加入氨水至体系PH值为10，80℃孵育2h，加入柠檬酸溶液100ml，继续反应30min，然后磁分离并用30%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，最后分散在2L含有PEG和吐温的磁珠基液中。
[0009]作为对上述提取试剂盒的进一步优化，所述纳米磁珠的ZETA电位不大于
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30。更进一步地，所述纳米磁珠的基液包含15%～30%PEG和1%～10%吐温20；所述纳米磁珠基液中PEG分子量不小于4000；所述纳米磁珠基液的表面张力不小于70达因/厘米。
[0010]本专利技术还提供利用上述提取试剂盒进行用于产前诊断的cfDNA的提取方法，包括以下步骤：步骤S1：取500～1200ul新鲜血浆样本于5ml或10ml离心管中，使用无菌移液器加入900～2500ul裂解结合液，50～90℃温浴震荡混匀10～30min；步骤S2：加入10～50ul纳米磁珠，震荡混匀5～15min；步骤S3：将经步骤S2处理的离心管置于磁力架上，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；步骤S4：使用无菌移液器向经步骤S3处理的离心管中加入500～800ul洗涤液，震荡混匀2min，置于磁力架上，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸弃上清溶液；步骤S5：使用无菌移液器向经步骤S4处理的离心管中加入30～50ul洗脱液，65℃温浴震荡混匀3～5min，然后置于磁力架上，待纳米磁珠完全吸附至管壁之后，使用无菌移液器吸取上清溶液进行cfDNA检测。
[0011]相比于现有技术，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术所述提取试剂盒采用多层夹心的羧基修饰PEG纳米磁珠，可无需洗脱而实现带磁珠扩增。特殊的裂解结合液与洗涤液等成份，可针对性地获得cfDNA，而无需单独去除基因组DNA。该试剂盒无需使用乙醇、异丙醇等成份。该试剂盒可手工操作，亦可在市面现有核酸自动提取仪上进行自动化操作，而无需定制特殊耗材，具有操作步骤简单、cfDNA得率高、敏感性好、运输方便的特点。尤其是利用本专利技术试剂盒及试剂盒提供的操作方法，可简单快速得到能够直接用于产前诊断的cfDNA样本，提高产前诊断的效率和灵敏性。
[0012]2、采用本专利技术所述所述提取试剂盒，所得cfDNA条带清晰、无杂峰。与现有的优势试剂盒相比，血浆用量更低，纯度和质量更高，浓度和总量方面更优，十分适合于产前诊断
的样本处理。
附图说明
[0013]图1是本专利技术实施例2得到的cfDNA电泳图；图2是对照得到的cfDNA电泳图。
具体实施方式
[0014]本专利技术提供了一种可用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，包括裂解结合液、纳米磁珠、洗涤液、洗脱液。
[0015]上述试剂盒，所述裂解结合液包括琥珀酸二异辛酯磺酸钠、异硫氰酸胍、盐酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，其特征在于：包含裂解结合液、纳米磁珠、洗涤液、洗脱液；所述裂解结合液的pH值为5.7～7.9，包括1.2～4.8M的琥珀酸二异辛酯磺酸钠、1.5～2.6mM的异硫氰酸胍、2.3～3.8mM的盐酸胍、1.3～3.4mM的SDS、1%～3.6%的 MES和10%～20%的PEG；所述纳米磁珠为以聚苯乙烯为核心，纳米四氧化三铁为夹心，以二氧化硅或纤维素为包覆，并用PEG包裹，然后进行羧基化修饰的纳米磁性颗粒；所述纳米磁珠为多层夹心结构，直径为400～2000nm，浓度为30～80mg/ml；所述洗涤液包括80～160mM十六烷基三甲基溴化铵、pH值为7.5～8.5的20～38mM Tris
‑
Hcl、5%～9%的ASEA和10～50mM的FMES；所述洗脱液的pH不低于8.0，包括EDTA和Tris
‑
Hcl。2.根据权利要求1所述的一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，其特征在于：所述裂解结合液中选用的PEG分子量大于2000。3.根据权利要求1所述的一种用于产前诊断的cfDNA提取试剂盒，其特征在于：所述纳米磁珠通过以下方法进行制备：a:选取粒径在400～700nm的聚苯乙烯微球100g，分散在1L的无水乙醇溶液中；b:加入按物质的量比为3:2配置的4mol/L的 Fe
3+
与Fe
2+
的混合盐溶液400ml，通入惰性气体除氧30min，调整体系温度为60～65℃，加入氨水至体系PH值为10，反应2h，加入50ml按体积3:2预混的油酸与月桂酸混合物，继续反应30min，然后迅速冷却至30℃，磁分离后，用50%乙醇及去离子水反复洗涤沉淀物数次至洗涤液为中性，然后分散在800ml无水乙醇中；c:加入正硅酸四乙酯和氨水200ml或羧甲基纤维素与氨水260m...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨科，
申请(专利权)人：河南省人民医院，
类型：发明
国别省市：