一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的引物对及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的引物对，包括正向引物和反向引物，采用所述引物对能够特异性地扩增人肠道中的脆弱拟杆菌。本发明专利技术公开了基于PCR技术的人肠道脆弱拟杆菌鉴定的方法，可直接以人类粪便为模板，检测其是否含有脆弱拟杆菌以及含有脆弱拟杆菌的相对丰度。本发明专利技术通过降低PCR缓冲液中MgCl2浓度，与配对脆弱拟杆菌16S rRNA的多对PCR引物组合试验，在调整PCR反应步骤的基础上，以获得最佳的实时定量PCR效果，并实现了对粪便稀释物的直接PCR鉴定。运用本发明专利技术的技术方案，可一次性、快速鉴定人类肠道中是否含有脆弱拟杆菌，无需对受试人粪便中肠道菌群的分离后再行鉴定。减少了试验步骤，节约检测时间。节约检测时间。节约检测时间。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的引物对及其应用


[0001]本专利技术属于荧光定量PCR检测领域，具体涉及一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的引物对，用于鉴定人肠道脆弱拟杆菌的荧光定量PCR反应体系及其应用。

技术介绍

[0002]脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)是临床上最常见的一种厌氧菌。能分解糖，对胆汁耐受，为类杆菌属的代表株。革兰氏阴性杆菌，两端钝圆而浓染，中间有不着色部份。在正常情况下，它能维持人体消化系统平衡和机体抵抗力，是免疫系统的驱动力，已被应用于健康领域。
[0003]脆弱拟杆菌对人体既有利，又有害，具有双重作用。它可以释放消炎物质，帮助免疫系统保持平衡。很多时候，它对我们的免疫系统发号施令，进行操纵。这种操纵并不会抑制或减弱我们免疫系统的性能，相反，还有助于免疫系统发挥功能。另一方面，脆弱拟杆菌常寄生于人的口腔、肠道和女性生殖道，是一种条件致病菌，主要为内源性感染，可引起女性生殖系统、胸腔和颅内感染。
[0004]现有鉴定脆弱拟杆菌的方法有基于形态学观察、生化试验、分子生物学实验等。脆弱拟杆菌的触酶试验阳性，发酵葡萄糖、麦芽糖和蔗糖，不发酵阿拉伯糖、鼠李糖、山梨醇和海藻糖，胆汁七叶苷试验阳性，吲哚试验阴性，耐20％胆盐。脆弱拟杆菌是革兰阴性杆菌，大小为(0.8～1.3)μm
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(1.6～8)μm，染色不均，两端圆而深染，中间不着色或染色较浅，似为空泡。培养物呈明显的多形性，在液体培养基尤其在含糖的培养基中，为长丝状或其他形状。
[0005]目前，已经公开报道基于分子生物学实验鉴定脆弱拟杆菌的方法有2个。谢湘峰等(巢式PCR结合微孔板杂交技术鉴定脆弱拟杆菌.中国实验诊断学,2002,(02):75)报道的方法，技术相对繁琐，涉及实验仪器和设备较多。张煜坤等(选择性培养基结合特异引物法分离鉴定家兔肠道脆弱拟杆菌.家畜生态学报,2015,36(03):58)报道的方法仅限于家兔肠道脆弱拟杆菌的鉴定。
[0006]人类粪便的主要成分包括水和固体成分，其中水约占总质量的四分之三，其余四分之一是固体。固体物质大多是蛋白质、无机物、脂肪、未消化的食物纤维、从肠道脱落的细胞和死掉的细菌、以及大量金属离子等。由于粪便成分的复杂性，且各组分含量不恒定，对于肠道特定菌种的生化或分子生物学鉴定带来了极大难度和不确定性。
[0007]目前，已有的检测脆弱拟杆菌的方法已经不能进一步满足对于人肠道中脆弱拟杆菌的直接检测和定量分析的要求。

技术实现思路

[0008]本专利技术公开了一种基于PCR技术的人肠道脆弱拟杆菌鉴定的方法，本专利技术可直接以人类粪便为模板，直接检测其是否含有脆弱拟杆菌以及含有脆弱拟杆菌的相对丰度。
[0009]本专利技术公开了一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的引物对，包括正向引物和反向引物，
所述正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
[0010]本专利技术公开了一种荧光定量PCR反应体系，包括：10
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PCR buffer、SYBR Green I、dNTP、模板、正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。
[0011]优选的，所述10
×
PCR buffer的配方为：500mmol/L KCl，100mmol/L pH 8.3Tris
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HCl，5
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50mmol/L MgCl2。
[0012]优选的，所述MgCl2浓度为5mmol/L。
[0013]优选的，所述10
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PCR buffer的溶剂为dd水或超纯水。
[0014]本专利技术公开了一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对和/或所述的反应体系。
[0015]优选的，所述试剂盒还包括脆弱拟杆菌标准品溶液。
[0016]优选的，所述标准品溶液为不同浓度的脆弱拟杆菌。
[0017]本专利技术公开了一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的方法，包括如下步骤：
[0018]1)将受试者粪便样本稀释制备成粪便稀释物；
[0019]2)将步骤(1)中的粪便稀释物作为模板建立PCR反应体系，所述反应体系包括：10
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PCR buffer、SYBR Green I、dNTP、模板、正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；
[0020]3)PCR扩增；
[0021]4)根据扩增结果判断样本中的脆弱拟杆菌是否存在。
[0022]优选的，所述方法为非疾病诊断目的。
[0023]优选的，所述10
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PCR buffer的配方为：500mmol/L KCl，100mmol/L pH 8.3Tris
‑
HCl，5
‑
50mmol/L MgCl2。
[0024]优选的，所述MgCl2浓度为5mmol/L。
[0025]优选的，所述步骤1)中的粪便样本稀释步骤为：取受试者粪便0.5g置于灭菌的1.5mL离心管，4℃存放，将所取样品溶于50mL生理盐水，从中吸取1mL悬浮液，用生理盐水稀释100倍，备用。
[0026]优选的，所述步骤3)中的PCR扩增条件为：(1)预变性，98℃，10min；(2)变性，96℃，30s；(3)退火，60℃，30s；(4)延伸，72℃，40s；(5)重复步骤(2)～(4)1次；(6)变性，96℃，30s；(7)退火，58℃，30s；(8)延伸，72℃，40s；(9)重复步骤(6)～(8)1次；(10)变性，96℃，30s；(11)退火，56℃，30s；(12)延伸，72℃，40s；(13)重复步骤(10)～(12)35次；(14)继续延伸，72℃，7min。
[0027]本专利技术公开了所述的引物对和/或所述的扩增体系在制备检测人肠道脆弱拟杆菌试剂盒中的用途。
[0028]本专利技术通过降低PCR缓冲液中MgCl2浓度，与配对脆弱拟杆菌16S rRNA的多对PCR引物组合试验，在调整PCR反应步骤的基础上，以获得最佳的实时定量PCR效果，并实现了对粪便稀释物的直接PCR鉴定。运用本技术，可一次性、快速鉴定人类肠道中是否含有脆弱拟杆菌，无需对受试人粪便中肠道菌群的分离后再行鉴定。本专利技术无需分离粪便中的肠道菌种后再行PCR，减少试验步骤，节约检测时间，达到了一步法快速鉴定肠道中是否含有脆弱拟杆菌的试验目的。
附图说明
[0029]图1为引物对1和引物对2对粪便样品的稀释液的实时定量PCR的溶解曲线，其中，箭头所指的溶解曲线是引物对2的扩增曲线，出现杂峰，且荧光信号较弱，说明扩增的特异性较差，而引物对1的溶解度曲线是单一特征峰，说明其扩增特异性好。
[0030]图2为引物对1对人粪便混合样品的稀释液和脆弱拟杆菌标准品实时定量PCR的溶解曲线，可见两组样品的溶解曲线完全重合。运用引物对3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的引物对，包括正向引物和反向引物，其特征在于，所述正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。2.一种荧光定量PCR反应体系，其特征在于，包括：10
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PCR buffer、SYBR Green I、dNTP、模板、正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示。3.根据权利要求2所述的反应体系，其特征在于，所述10
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PCR buffer的配方为：500mmol/L KCl，100mmol/L pH 8.3Tris
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HCl，5
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50mmol/L MgCl2；优选的，所述MgCl2浓度为5mmol/L。4.一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对和/或权利要求2
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3任一权利要求所述的反应体系。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括脆弱拟杆菌标准品溶液。6.一种鉴定人肠道脆弱拟杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)将受试者粪便样本稀释制备成粪便稀释物；2)将步骤(1)中的粪便稀释物作为模板建立PCR反应体系，所述反应体系包括：10
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PCR buffer、SYBR Green I、dNTP、模板、正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物的序列分别如SEQ ID NO:1和2所示；3)PCR扩增；...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛健，王昊炜，徐奚如，
申请(专利权)人：南京法迈特科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：