一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法技术

本发明专利技术公开了一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法，步骤包含以下几步：(1)将EP管中细胞培养上清融化，加热预处理，得预处理液；(2)犬尿氨酸标准液处理预处理液后，静置10～15分钟，酶标仪检测A

【技术实现步骤摘要】
一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法


[0001]本专利技术涉及C12Q1/00领域，尤其涉及一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSCs)作为干细胞的一种，其广泛存在于机体的大部分组织中，可以从骨髓、脂肪、肌肉等组织中分离获得，具有跨胚层分化的特性，可以分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、神经细胞等，参与组织的再生修复和机体内环境稳态的维持。而吲哚胺2，3
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双加氧酶1(IDO1)的表达是间充质干细胞进行神经细胞再生和免疫系统调节的前提，因此，近些年来对于间充质干细胞的吲哚胺2，3
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双加氧酶1活性表达的研究也呈现出逐年上升的趋势，而吲哚胺2，3
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双加氧酶1活性表达的检测也成为了最近研究的热点。
[0003]现有技术(CN202011561297.0)公开了一种满足产品放行要求的免疫调节干细胞IDO1活性检测方法，声称建立了相对生物活性的检验方法，且能够有效的剔除检测结果中的不正确结果。但是，其使用的间充质干细胞完全培养基不能够有效的减少培养基中游离自由基对于干细胞的脂质、蛋白和DNA的负面氧化影响，并且不能够促进干细胞的细胞膜通透性，进而减少干细胞的损坏情况，并且其对检测结果的分析步骤较为简便，不能进一步的提高活性检测结果的准确性。
[0004]因此，为了解决上述问题，亟需一种能够有效培育数量较多间充质干细胞，且在培育过程中大大减少干细胞损失，从而使得IDO1活性检测结果准确度明显提高的检测方法和检测数据处理方法，两者相同作用，提高间充质干细胞中IDO1活性的检测结果的准确度。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术第一方面提供了一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法，步骤包含以下几步：(1)将EP管中细胞培养上清融化，加热预处理，得预处理液；(2)犬尿氨酸标准液处理预处理液后，静置10～15分钟，酶标仪检测A
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值；(3)以A
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值和犬尿氨酸标准液浓度绘制标准曲线，计算回归方程；(4)计算活性培养基培养组和基础培养基培养组的A
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值差值，并带入回归方程获得所需数据。
[0006]在一些优选的实施方式中，所述步骤(1)的具体方法为：(1)将EP管中的细胞培养上清融化，离心，去除悬浮细胞；(2)离心后每支EP管取120～180μL上清，加入新的EP管中，各加入30～50μL的30wt％三氯乙酸溶液，涡旋混匀；(3)混匀后，50℃加热反应30分钟，反应后离心处理10分钟，得预处理液。
[0007]在一些优选的实施方式中，所述步骤(2)的具体方法为：在每支EP管中取100μL预处理液，分别加入96孔板中，各浓度的犬尿氨酸标准液各取100μL加入96孔板中，每孔加入100μL 2wt％的对二甲氨基苯甲醛溶液，混匀，室温静置10分钟，用酶标仪检测A
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值。
[0008]在一些优选的实施方式中，各浓度的犬尿氨酸标准液的制备步骤包含以下几步：(1)用超纯水和犬尿氨酸首先配制500μmol/L浓度的犬尿氨酸标准液；(2)取一半体积的犬
尿氨酸标准液与等体积超纯水混合，依次配制浓度分别为250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9μmol/L的犬尿氨酸标准液；(3)取超纯水作为0μmol/L的犬尿氨酸标准液。
[0009]在一些优选的实施方式中，所述步骤(3)的具体方法为：以超纯水的吸光度A
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值作为背景值，其余不同浓度犬尿氨酸标准液A
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值减去背景值为A
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校正值，分别以A
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校正值和犬尿氨酸标准液浓度绘制标准曲线，计算回归方程。
[0010]在一些优选的实施方式中，所述步骤(4)的具体方法为：计算活性培养基培养组和基础培养基培养组的A
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值差值，根据回归方程和A
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差值计算得到间充质干细胞经药物处理后的犬尿氨酸浓度，以及数据的SD和RSD值，从而评估间充质干细胞IDO1的活性和免疫调节能力。
[0011]在一些优选的实施方式中，所述细胞培养上清的制备步骤包含以下几步：(1)使用24孔板接种培养细胞，每孔加入0.3～0.6mL的基础培养基，共接种12孔，将24孔板置于37℃，5.0％CO2细胞培养箱中第一次培养22～26小时；(2)第一次培养完成后，吸弃基础培养基，向其中6孔中加入0.3～0.6mL的活性培养基，另外6孔再次加入0.3～0.6mL的基础培养基，将24孔板置于37℃，5.0％CO2细胞培养箱中第二次培养23～25小时；(3)培养完成后，将培养上清全部吸取，加入EP管中，将样品分为活性培养基培养组和基础培养基培养组，将所有样品放入
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20℃以下冰箱中保存。
[0012]在一些优选的实施方式中，所述基础培养基为无血清培养液和血清替代物以体积比1：16～19配制。
[0013]在一些优选的实施方式中，所述活性培养基为为含有γ干扰素的基础培养基；所述活性培养基中γ干扰素的浓度为7～11ng/mL。
[0014]在一些优选的实施方式中，所述活性培养基中还加入了阿夫儿茶精和人脂质运载蛋白2；所述阿夫儿茶精(CAS:2545
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00
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8)和人脂质运载蛋白2的浓度比为1～3：5～7。
[0015]在一些优选的实施方式中，所述阿夫儿茶精的浓度为4～12μg/mL；所述人脂质运载蛋白2的浓度为20～28μg/mL。
[0016]本专利技术申请中，在活性培养基中加入少量的阿夫儿茶精和人脂质运载蛋白2，并当两者的浓度分别为4～12μg/mL和20～28μg/mL且浓度比为1～3：5～7时，能够在培养细胞过程中增强间充质干细胞的增殖速率、贴壁效率并有效减少了干细胞在培养期间的整体损失，抑制干细胞衰老，从而提升培养上清的最终检测准确度，最终增强检测数据处理方法所得数据的SD值和RSD值。本申请人推测为：当两者的浓度比为1～3：5～7时，人脂质运载蛋白2能够有效促进间充质干细胞的增殖速率，并且有效抑制干细胞的衰老，提升干细胞的培养效果；此时，阿夫儿茶精的存在可以有效激发干细胞抗氧化酶的活性，配合其自身的自由基消除效果，有效避免游离自由基对于干细胞和培养基中酯质和DNA的负面影响，更重要的是避免人脂质运载蛋白2因为自由基的攻击而失活，两者协同作用还能够有效的提高阿夫儿茶精的活性，在干细胞培养过程中降低间充质干细胞在培养过程中的细胞膜通透性，减少细胞的细胞膜结构损坏情况。当阿夫儿茶精的浓度过低时，自由基消除效率较低，抗氧化活性酶的活性较低，人脂质运载蛋白2等蛋白质容易失活，从而影响间充质干细胞的增殖和培养；当阿夫儿茶精的浓度过高时，干细胞的细胞膜的通透性过低，容易从而出现细胞内外物质交换困难的现象，从而导致间充质干细胞损失。
[0017本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法，其特征在于：步骤包含以下几步：(1)将EP管中细胞培养上清融化，加热预处理，得预处理液；(2)犬尿氨酸标准液处理预处理液后，静置10～15分钟，酶标仪检测A
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值；(3)以A
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值和犬尿氨酸标准液浓度绘制标准曲线，计算回归方程；(4)计算活性培养基培养组和基础培养基培养组的A
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值差值，并带入回归方程获得所需数据。2.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法，其特征在于：所述步骤(1)的具体方法为：(1)将EP管中的细胞培养上清融化，离心，去除悬浮细胞；(2)离心后每支EP管取120～180μL上清，加入新的EP管中，各加入30～50μL的30wt％三氯乙酸溶液，涡旋混匀；(3)混匀后，50℃加热反应30分钟，反应后离心处理10分钟，得预处理液。3.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法，其特征在于：所述步骤(2)的具体方法为：在每支EP管中取100μL预处理液，分别加入96孔板中，各浓度的犬尿氨酸标准液各取100μL加入96孔板中，每孔加入100μL 2wt％的对二甲氨基苯甲醛溶液，混匀，室温静置10分钟，用酶标仪检测A
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值。4.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体方法为：以超纯水的吸光度A
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值作为背景值，其余不同浓度犬尿氨酸标准液A
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值减去背景值为A
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校正值，分别以A
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校正值和犬尿氨酸标准液浓度绘制标准曲线，计算回归方程。5.根据权利要求1所述的一种人间充质干细胞IDO1活性数据的处理方法，其特征在于：所述步骤(...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱灏，葛晨曦，张钰，吴丹枫，
申请(专利权)人：华夏源上海生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：