一种产甲烷菌培养基及培养方法技术

本发明专利技术提供产甲烷菌的培养基及培养方法，所述培养基包括8g/L的甲酸钠和4g/L的乙酸钠。通过增加或额外添加培养基中的甲酸钠和乙酸钠至8g/L的甲酸钠和4g/L的乙酸钠，并通入80％氮气+20％二氧化碳的混合气，可在不使用氢气的条件下培养产甲烷菌，并使产甲烷菌快速大量生长。生长。

【技术实现步骤摘要】
一种产甲烷菌培养基及培养方法


[0001]本专利技术涉及一种产甲烷菌的培养基及培养方法，尤其是具有甲酸脱氢酶(FDH)的氢营养型产甲烷菌的培养基及培养方法，尤其是在实验室培养中。

技术介绍

[0002]产甲烷菌是一种生存于绝对无氧环境中的古细菌。产甲烷菌的培养要求绝对无氧的还原性体系，苛求二氧化碳、甲醇、甲酸、乙酸等简单碳化合物实现能量代谢，且通常只能利用这些简单碳化合物实现能量代谢，而不能使用常见的复杂碳源如葡萄糖、丙酮酸钠、乳酸钠等，极难在实验室中培养。
[0003]甲烷产生是产甲烷菌生长的唯一能量代谢途径。产甲烷菌主要有三种产甲烷途径，分别利用氢气+二氧化碳、乙酸、甲基化合物。据此可将产甲烷菌分为氢营养型、乙酸发酵型、甲基营养型。根据产甲烷菌的代谢途径、形态、系统发育关系等特征，可将产甲烷菌分为6目、13科、33属。
[0004]一半以上的产甲烷菌为氢营养型(23属)，即利用氢气作为电子供体、二氧化碳作为电子受体，通过产甲烷菌特有的产甲烷途径实现能量代谢，进而实现产甲烷菌的实验室培养。然而，用这种方式培养产甲烷菌需要在培养容器中持续通入80％氢气和20％二氧化碳混合气30分钟以上以彻底排除氧气，每次制作培养基10
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50mL泄漏的氢气量可高达200L以上。易燃易爆的高浓度氢气对实验室安全造成很大隐患，也提高了产甲烷菌培养的实验室基础设施门槛。因此，改良产甲烷菌培养方式，避免使用高浓度氢气作产甲烷菌培养底物，是产甲烷菌实验室培养的重大需求。

技术实现思路

[0005]75％(18属)的氢营养型产甲烷菌具有甲酸脱氢酶(Formate dehydrogenase，FDH)，可催化氢气、二氧化碳与甲酸的相互转化。因此理论上使用甲酸(或甲酸盐)代替氢气、二氧化碳作为具有FDH的产甲烷菌培养底物在原理上是可行的。
[0006]尽管许多氢营养型产甲烷菌被证明可以利用甲酸产甲烷，但除少数产甲烷菌(如Methanobacterium formicicum)外，大部分使用甲酸培养的产甲烷菌面临生长缓慢、生物量低等问题，难以实现产甲烷菌的大量培养。因此，当前主流微生物保藏中心(美国ATCC、德国DSMZ)给出的氢营养型产甲烷菌培养基均使用80％H2+20％CO2培养(如DSM medium 119、DSM medium 141、DSM medium 1523、ATCC medium 1405、ATCC medium2487等)。而在最近使用这些产甲烷菌纯培养物进行科学研究的论文中，也均使用氢气培养。
[0007]本专利技术提供一种不使用氢气的产甲烷菌的实验室培养方法。
[0008]本专利技术提供如下技术方案：
[0009]一方面，本专利技术提供产甲烷菌的培养基，其特征在于，所述培养基包括8g/L的甲酸钠和4g/L的乙酸钠。
[0010]在一些实施方案中，所述产甲烷菌为具有甲酸脱氢酶的氢营养型产甲烷菌。
[0011]在一些实施方案中，产甲烷菌选自亨氏甲烷螺菌、海沼甲烷球菌、甲酸甲烷杆菌、甲烷叶菌和巴伐利亚甲烷粒菌。
[0012]在一些实施方案中，所述培养基还包括磷酸盐、硫酸盐、氯化物、微量金属元素、刃天青指示剂、半胱氨酸、硫化钠和维生素。
[0013]在一些实施方案中，所述培养基还包括蛋白胨和酵母提取物。
[0014]在一些实施方案中，所述蛋白胨为蛋白胨或胰蛋白胨。
[0015]在一些实施方案中，所述磷酸盐包括磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钾中的一种或多种。
[0016]在一些实施方案中，所述磷酸盐包括为磷酸二氢钾。
[0017]在一些实施方案中，所述磷酸盐包括为无水磷酸氢二钾。
[0018]在一些实施方案中，所述硫酸盐包括七水硫酸镁、六水硫酸亚铁铵中的一种或多种。
[0019]在一些实施方案中，所述硫酸盐为七水硫酸镁。
[0020]在一些实施方案中，所述硫酸盐为七水硫酸镁和六水硫酸亚铁铵。
[0021]在一些实施方案中，所述氯化物包括氯化钠、氯化铵、二水氯化钙、氯化钾、六水氯化镁中的一种或多种。
[0022]在一些实施方案中，所述氯化物包括氯化钠、氯化铵和二水氯化钙。
[0023]在一些实施方案中，所述氯化物包括氯化铵、二水氯化钙、氯化钾和六水氯化镁。
[0024]在一些实施方案中，所述微量金属元素包括：铁、锌、锰、钴、铜、镍、钼、钠、钙、铝、钾中的一种或多种。
[0025]在一些实施方案中，所述微量金属元素包括：铁、锌、锰、钴、铜、镍、钼和钠。
[0026]在一些实施方案中，所述微量金属元素包括：铁、锌、锰、钴、铜、镍、钠、钙、铝和钾。
[0027]在一些实施方案中，所述维生素包括：维生素B12、对氨基苯甲酸、生物素、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、叶酸、核黄素、硫辛酸中的一种或多种。
[0028]在一些实施方案中，所述维生素包括：维生素B12、对氨基苯甲酸、生物素、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺素。
[0029]在一些实施方案中，所述维生素包括：维生素B12、对氨基苯甲酸、生物素、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、叶酸、核黄素和硫辛酸。
[0030]在一些实施方案中，8g/L的甲酸钠和4g/L的乙酸钠在标准培养基的基础上添加或补加，所述标准培养基为DSM medium 119、DSM medium141、DSM medium 1523、ATCC medium 1405或ATCC medium 2487。
[0031]在一些实施方案中，所述标准培养基为DSM medium 1523。
[0032]在一些实施方案中，所述标准培养基为DSM medium 141。
[0033]在一些实施方案中，所述标准培养基为DSM medium 141c。
[0034]另一方面，本专利技术提供产甲烷菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括在如上所述的培养基中接种产甲烷菌，并在所述培养基中通入80％氮气+20％二氧化碳的混合气，对所述产甲烷菌进行培养。
[0035]在一些实施方案中，所述培养方法还包括监测产甲烷菌生长情况，若怀疑有污染风险，则鉴定产甲烷菌种类。
864)(DSM 864是德国菌种保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)赋予保藏微生物的编号，可直接从该菌种保藏中心购买微生物)、海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis，DSM 2067)(DSM 2067是德国菌种保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)赋予保藏微生物的编号，可直接从该菌种保藏中心购买微生物)、甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicicum，DSM 1535)(DSM 1535是德国菌种保藏中心(Ger本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.产甲烷菌的培养基，其特征在于，所述培养基包括8g/L的甲酸钠和4g/L的乙酸钠。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括磷酸盐、硫酸盐、氯化物、微量金属元素、刃天青指示剂、半胱氨酸、硫化钠和维生素。3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括蛋白胨和酵母提取物。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的培养基，其特征在于，所述微量金属元素包括：铁、锌、锰、钴、铜、镍、钼、钠、钙、铝、钾中的一种或多种。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的培养基，其特征在于，所述维生素包括：维生素B12、对氨基苯甲酸、生物素、烟酸、泛酸钙、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、叶酸、核黄素、硫辛酸中的一种或多种。6.产甲烷菌的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括在根据权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：胡立刚，高峻，陶少洋，何滨，江桂斌，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：