用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法技术

用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法，属于分子生物学技术领域，该方法用于对基因组中MAGEL2基因进行表达分析，进而对染色体15q11.2

【技术实现步骤摘要】
用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及人类染色体15q11.2
‑
q13区域PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法。

技术介绍

[0002]基因组印记(Genomic Imprinting)是一种特殊的表观遗传现象，是哺乳动物胚胎正常发育所必需的。基因组印记是指在二倍体细胞中，某些基因只有一个等位基因可以表达，且表达具有亲本特异性，即只有来自父本或母本一方的等位基因表达，而另一等位基因不表达或表达量很低。在胚胎发育、胎盘功能及人类疾病中均发挥关键作用，其功能异常可引发胚胎源性死胎、神经功能紊乱等，并可导致多种印记相关疾病，如Prader
–
Willi综合征(PWS)和Angelman综合征(AS)。大多数印记基因在染色体上是成簇存在的，成簇存在的印记基因的表达受印记区上印记调控区(Imprinting Control Region，ICR)的顺式调控元件的控制。ICR的甲基化程度在两条同源染色体上是不同的，这种差异性甲基化控制着胚胎中印记基因的正确表达。
[0003]15号染色体从染色体长臂端粒至着丝粒方向可依次分为远端非印记区域、Angelman综合征(AS)印记区、PWS印记区及非印记区域(近着丝粒处断裂点BPl和BP2间)4个亚区：在其PWS印记区包含仅父系表达的5个多肽编码基因(MKRN3、MAGEL2、NECDIN、双顺反子SNURF
‑
SNRPN、C15orf2)，一组核仁小RNA(snoRNAs)以及一些反义转录本。在人类，PWS印记区域内的基因仅在神经系统高表达，而在其他组织低表达或无表达；由于组织无法获取，给该区域的表达分析带来了难度；且由于该区域结构的特殊性，传统技术对这一染色体区域进行分析常常需要多种技术联合应用才能明确基因的表达情况，如染色体核型分析、荧光原位杂交技术(FISH)、比较基因组杂交(aCGH)、DNA甲基化分析、MS
‑
MLPA和DNA多态性等。上述技术不仅分析周期长、技术难度大、技术要求高，而且费时费力、费用较高，且需要多种技术联合才能得到明确结果，增加了患者的经济负担。迫切需要一种经济、简便、简单易行的检测方法对印记区域的基因表达情况进行分析。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在克服上述现有技术中的缺陷，提供一种可供临床选择的简单、易行、经济的用于染色体15q11.2
‑
q13区域PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法，该方法用于对基因组中MAGEL2基因进行表达分析，进而对15q11.2
‑
q13区域的印记状态进行评估，以达到快速简便、准确度高的效果。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]提供一种围生期染色体15q11.2
‑
q13区域印记基因表达分析的方法，包括选择检测的组织类型、检测项目及内容、判断标准。
[0007]组织类型：胎盘组织。
[0008]检测项目及内容：对胎盘组织中的mRNA进行提取，进行MAGEL2基因的PCR检测。
MAGEL2基因(OMIM：605283)位于15号染色体q11.2
‑
q13的PWS印记区，是黑色素瘤抗原基因家族(melanoma antigen gene family，MAGEs)的一员，编码1249个氨基酸，介导蛋白间相互作用；在调节细胞周期、受体循环、神经元信号转导及神经轴突生长等过程中发挥重要作用。该基因位于PWS关键区域内，正常情况下是一种母系印记、父源表达的基因；胚胎期MAGEL2在神经系统广泛表达，出生后MAGEL2 mRNA表达局限于在大脑的特定区域，尤其是下丘脑视交叉上核和室旁核。由于组织无法获取，给表达分析带来了难度。经数据库查询及文献检索：
[0009]在人类，该基因在胎儿脑和胎盘中优势表达，且仅由未甲基化的父本等位基因表达，且与胎儿体内的表达情况相同。故可根据胎盘中MAGEL2基因的PCR扩增结果实现对胎儿体内该基因乃至PWS关键区基因表达情况的评估。
[0010]通过引入一内参基因ACTB，选择适当的扩增片段，并设定与MAGEL2基因扩增产物相近的Tm值(解链温度)，从而实现对MAGEL2基因扩增情况的有效评估。
[0011]内参基因引物序列：
[0012][0013]目标产物
[0014]>NM_001101.5 Homo sapiens actin beta(ACTB),mRNA
[0015]产物长度＝250bp
[0016]MAGEL2基因引物序列：
[0017][0018][0019]目标产物
[0020]>NM_019066.5 Homo sapiens MAGE family member L2(MAGEL2),mRNA
[0021]产物长度＝131bp
[0022]反应体系：
[0023]将cDNA模板1
‑
4μl(20
‑
1000ng/μl)，MAGEL2和ACTB的上游引物和下游引物各自分别0.5
‑
2μl(5μM)，dNTP 0.5
‑
2μl(10mM)，10xPCR缓冲液2.5
‑
10μl，MgCl
2 2.0
‑
8μl(25mmol/L)，Taq DNA聚合酶1
‑
4U混合，加水补足至25
‑
100μl。
[0024]反应条件：
[0025]95℃起始变性4min；95℃变性40sec，58
‑
61℃退火40sec，72℃延伸40sec，35个循环；72℃延伸10min。
[0026]判断标准：
[0027]采用PCR的方法，对胎盘mRNA进行反转录后，通过cDNA进行PCR扩增。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。并设定内参基因以监测反应体系及提取RNA的有效性。(须有阴阳质控监测反应体系)
[0028] PWS印记区有表达PWS印记区无表达目标基因(MAGEL2)+
‑
内参基因(ACTB)++
[0029]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0030]本专利技术所采用的检测方法具有快速、高通量、所需标本量少、价格低廉、操作简单、所需仪器设备为实验室常用设备，易于临床实验室开展。
[0031]由于染色体15q11.2
‑
q13区域基因多为印记基因，且表达组织类型局限，多数出生后仅在脑中特定区域高表达，组织不易获得或无法获得；本专利技术通过数据库检索及查阅文献，成功检索到该基因在胎儿期除在脑中高表达外，亦在胎盘表达，且仅父源表达。通过这一信息，为本专利技术提供了理论依据及参考。
附图说明
[0032]图1检测后的模拟电泳图。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法，其特征在于，其特征在于，包括选择检测的组织类型、检测项目及内容、判断标准；组织类型：胎盘组织；检测项目及内容：对胎盘组织中的mRNA进行提取，进行MAGEL2基因的PCR检测；所述PCR检测过程还包括引入内参基因ACTB，选择扩增片段，设定与MAGEL2基因扩增产物相近的Tm值；判断标准：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果：若内参基因ACTB有扩增条带，同时MAGEL2有扩增条带，则间接证明染色体15q11.2
‑
q13印记区域有表达；若内参基因ACTB有扩增条带，同时MAGEL2无扩增条带，则间接证明染色体15q11.2
‑
q13印记区域无表达。2.根据权利要求1所述的用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法，其特征在于，内参基因引物序列：序列(5'
‑
>3')上游引物：CATGTACGTTGCTATCCAGGC引物长度：21bp模板起始位置：477模板终止位置：497Tm：59.13℃GC：52.38％下游引物：CTCCTTAATGTCACGCACGAT引物长度：21bp模板起始位置：706模板终止位置：726Tm：58.46℃GC：47.62％目标产物>NM_001101.5Homo sapiens actin beta(ACTB),mRNA产物长度＝250bp。3.根据权利要求1所述的用于PWS印记区基因表达分析的多重PCR检测方法，其特征在于，MAGEL2基因引物序列：序列(5'

【专利技术属性】
技术研发人员：赵艳辉，孙晓，王晓彩，庞泓，
申请(专利权)人：沈阳市妇婴医院，
类型：发明
国别省市：