壳寡糖NMR波谱的归属及脱乙酰度相关指标的测定方法技术

本发明专利技术属壳寡糖的核磁分析技术领域。本发明专利技术针对乙酸、乙酸盐的乙酰甲基与壳寡糖结构中的N

【技术实现步骤摘要】
壳寡糖NMR波谱的归属及脱乙酰度相关指标的测定方法


[0001]本专利技术属于壳寡糖的核磁分析
，具体涉及壳寡糖的NMR波谱的 归属及脱乙酰度相关指标的测定方法。

技术介绍

[0002]壳寡糖是由氨基葡萄糖和N
‑
乙酰氨基葡萄糖两种糖单元构成，为壳聚糖 的降解产物，因此，壳寡糖的分子结构与壳聚糖的类似，只是壳寡糖的平均 聚合度已大幅度降低。与壳聚糖相比，壳寡糖具有良好的水溶性，其生物活 性如抗菌、抗肿瘤、增强免疫调节功能等已在医药、化妆品、食品、纺织、 造纸等领域得到广泛应用。壳寡糖也被称为低聚合度的水溶性壳聚糖，它可 溶于酸性、中性和碱性溶液。脱乙酰度(DD)可被定义为氨基葡萄糖单元在壳 寡糖分子中所占的摩尔百分数。氨基葡萄糖单元是决定壳寡糖生物活性的关 键结构，因此，DD是壳寡糖质量控制的重要参数。
[0003]有关壳聚糖的脱乙酰度测定方法报道较多，但针对壳寡糖的脱乙酰度测 定方法却鲜有报道，究其原因，壳寡糖产品中往往含乙酸和/或盐酸而影响了 DD的准确测定。壳寡糖产品中含酸的原因主要有以下几点：(1)壳寡糖的 分子量较小，单位质量所含有的具有还原性的半缩醛基明显多于壳聚糖，而 这些半缩醛基极易与壳寡糖分子中的氨基葡萄糖单元中的氨基发生美拉德 反应，为防止壳寡糖变质，往往会在壳寡糖产品中添加酸以保护氨基，以抑 制该反应进行；(2)出于绿色、安全、环保的考虑，壳寡糖绝大部分来源于 壳聚糖的酶法降解，其酶解最适pH常需要添加乙酸维持；(3)壳聚糖不溶 于水，在降解之前需先溶于酸性溶液，降解后的壳聚糖中会有酸残留；(4) 壳聚糖只能溶于有限的几种酸性的稀溶液，从低成本考虑，以稀盐酸为最佳， 但盐酸为强酸，极易使壳寡糖继续降解而降低壳寡糖应有的生物活性，因此， 在壳寡糖产品中往往会加入成本同样较低的乙酸。
[0004]乙酸的添加对壳寡糖的脱乙酰度的准确测定带来极大麻烦，常用于测定 壳聚糖的脱乙酰度的方法如元素分析法、电位滴定法、红外法、紫外一阶导 数法均无法应用于壳寡糖的脱乙酰度的测定。元素分析法是基于壳寡糖分子 中的碳氮比，而含碳的乙酸则会干扰其测定。红外法是基于乙酰基的甲基、 羰基相关的振动峰的定量测定，由于酸的存在，壳寡糖分子中的
‑
NH2部分 或全部变为
‑
NH
3+
，而这两种基团的N
‑
H弯曲振动完全不同而影响到乙酰基 的C＝O伸缩震动峰，因而无法使用壳聚糖的红外测定法测定壳寡糖的脱乙 酰度。电位滴定法是基于对壳寡糖分子中的氨基的测定，由于乙酸是弱酸， 而氨基为弱碱，很难观测到滴定位点而影响氨基含量的测定，再者，壳寡糖 往往以部分盐的形式存在，有可能既有乙酸盐又有盐酸盐，给DD值的计算 带来了麻烦，此外，该法耗时冗长，检测效率低，不便于大批量测定。紫外 一阶导数法的测定基于壳寡糖分子中的乙酰基，而壳寡糖产品中所添加的乙 酸会直接影响测定结果，该法更适合于不含乙酸的壳寡糖DD的测定。行业 中长期以来以壳寡糖样品的质量占比来间接表示壳寡糖的脱乙酰度，而非壳 寡糖分子结构的氨基葡萄糖单元的摩尔占比，而以摩尔占比计量脱乙酰度更 能够体现壳寡糖分子的结构特征。
[0005]现有技术中核磁法是公认的测定壳寡糖的脱乙酰度最为准确的方法，该 方法是根据壳寡糖分子中不同氢质子的化学位移值的不同，通过测试样品氢 质子的积分面积与所选参比氢质子积分面积比较，计算出壳寡糖DD值。然 而，1H
‑
NMR法也有不足之处：壳寡糖产品中所添加的乙酸的甲基质子峰与 乙酰基的甲基质子峰的化学位移相近，很难区分。有的学者认为1.92ppm处 的甲基质子峰归属于N
‑
乙酰基(Jiang,Y.,Fu,C.H.,Wu,S.H.,Liu,G.H.,Guo, J.,&Su,Z.Q.(2017).Determination of the Deacetylation Degree ofChitooligosaccharides.Marine drugs,15(11))，也有学者认为它们都属于N
‑
乙 酰基(Jiang,Z.,Liu,G.,Yang,Y.,Shao,K.,Wang,Y.,Liu,W.,&Han,B.(2019). N
‑
Acetyl chitooligosaccharides attenuate amyloidβ
‑
induced damage in animaland cell models of Alzheimer
’
s disease.Process Biochemistry,84,161
‑
171.)。乙 酰基的甲基质子峰如果归属不清，将直接导致脱乙酰度的测定出现极大偏 差，这极不利于壳寡糖的质量控制与应用。因此，准确归属这两个甲基质子 峰是当前亟需解决的问题，该问题的解决是准确测定壳寡糖的脱乙酰度和乙 酸添加量的必要前提。

技术实现思路

[0006]核磁法测定壳寡糖脱乙酰度的技术存在壳寡糖产品中所添加的乙酸的 甲基质子峰与壳寡糖的乙酰基的甲基质子峰的化学位移相近，难以区分，不 同的归属会直接导致测定结果出现极大偏差，针对上述问题本专利技术的目的在 于提供一种壳寡糖NMR的波谱归属及脱乙酰度相关指标的测定方法，通过比 对壳寡糖核磁样品在两种温度下的谱图上甲基质子峰的位移变化情况，从而 可以准确判断出N
‑
乙酰基的甲基质子峰H
AC
与乙酸的甲基质子峰H
A
的波谱 归属，进而实现了壳寡糖脱乙酰度的准确测定。
[0007]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0008]一方面，本专利技术提供一种壳寡糖的核磁共振谱图的波谱归属方法，具体 包括以下步骤：
[0009](1)壳寡糖核磁样品溶液的制备
[0010]将干燥的壳寡糖样品分别完全溶解于氘代试剂D2O，然后用NaOD溶液调 pH值至5.4
‑
6.2得样品溶液；
[0011](2)样品测试
[0012]将步骤(1)中制备的样品溶液分别置于核磁共振仪中，分别在两个不同的 温度下测试，获得壳寡糖的核磁共振谱图；这两个不同温度的温差足以引起核 磁共振谱图上低场区出现可分辨的化学位移值的变化；
[0013](3)波谱归属
[0014]将在较高温度测得的壳寡糖样品的核磁共振谱图与在较低温度测得的核磁 共振谱图进行比较，在高场区将化学位移值未因升高测试温度而发生变化或略 向高场移动的位于2.07
±
0.01ppm的质子峰确定为壳寡糖的N
‑
乙酰基的甲基质 子峰H
AC
，将化学位移值向低场移动的位于1.93
±
0.02ppm的质子峰确定为壳寡 糖样品中因添加乙酸而产生的甲基质子峰H
A
；化学位移值4.18～3.11ppm的质子 峰群为壳寡糖的H2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种壳寡糖的核磁共振谱图的波谱归属方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)壳寡糖核磁样品溶液的制备将干燥的壳寡糖分别完全溶解于氘代试剂D2O，然后用NaOD溶液调pH值至5.4
‑
6.2得样品溶液；(2)样品测试将步骤(1)中制备的样品溶液分别置于核磁共振仪中，分别在两个不同的温度下测试，获得壳寡糖的核磁共振谱图；这两个不同温度的温差足以引起核磁共振谱图上高场区出现可分辨的化学位移值的变化；(3)波谱归属将在较高温度测得的壳寡糖样品的核磁共振谱图与在较低温度测得的核磁共振谱图进行比较，在高场区将化学位移值未发生变化或略向高场移动的位于2.07
±
0.01ppm的质子峰确定为壳寡糖的N
‑
乙酰基的甲基质子峰H
AC
，将化学位移值向低场移动的位于1.93
±
0.02ppm的质子峰确定为壳寡糖样品中因添加乙酸而产生的甲基质子峰H
A
；化学位移值4.18～3.11ppm的质子峰群为壳寡糖的H2‑
H6的6个质子峰的总和H2‑6。2.根据权利要求1所述的壳寡糖的核磁共振谱图的波谱归属方法，其特征在于，所述的步骤(1)所述壳寡糖样品的干燥方法为：在60℃下干燥1
‑
2小时，升温至80℃干燥1
‑
2小时，再继续升温至105℃干燥0.5
‑
1小时，干燥至恒重。3.根据权利要求1所述的壳寡糖的核磁共振谱图的波谱归属方法，其特征在于，所述的步骤(1)中壳寡糖样品的浓度为5
‑
20mg/mL。4.根据权利要求1所述的壳寡糖的核磁共振谱图的波谱归属方法，其特征在于，所述步骤(2)一个测试温度的范围为20
‑
30℃，另一个测试温度的范围为60
‑
80℃。5.根据权利要求4所述的壳寡糖的核磁共振谱图的波谱归属方法，其特征在于，所述步骤(2)一个测试温度为25℃，另一个测试温度为70℃。6.一种测定壳寡糖的脱乙酰度的方法，其特征在于，在权利要求5所述的一种壳寡糖的核磁共振谱图的波谱归属方法的基础上，还包括以下步骤：(4)质子峰的面积积分与计算计算N
‑
乙酰基的甲基质子峰H
AC
的面积积分为I
AC
；乙酸的甲基质子峰H
A
的积分为I
A
；壳寡糖的6个质子峰H2‑6的积分总和为I2‑6；则脱乙酰度DD、乙酸添加量D
A

【专利技术属性】
技术研发人员：张永勤，吕兴霜，陈相玉，邬雅喃，刘银春，董静文，刘建瑞，刘芳，王滕斌，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：