一种血液样本分离和冻存的方法技术

本发明专利技术属于血液样本处理技术领域，具体涉及一种血液样本分离和冻存的方法。本发明专利技术对待分离血液分别进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血；分别对抗凝血和促凝血进行处理，得到全血、血浆、白膜层液体、少浆血、血清和血凝块，包括了全血样本，细胞样本和核酸样本，丰富了样本种类，保证了样本类型的完整。本发明专利技术采用不同的冻存方法对多种样本进行冻存，能够保证细胞样本复苏后的活率以及核酸样本的浓度和纯度，样本质量可靠。样本质量可靠。

【技术实现步骤摘要】
一种血液样本分离和冻存的方法


[0001]本专利技术属于血液样本处理
，具体涉及一种血液样本分离和冻存的方法。

技术介绍

[0002]血液是流动在动物血管和心脏中的一种红色不透明的黏稠液体。血液由血浆和血细胞组成，一升血浆中含有900
‑
910克的水，65
‑
85克的蛋白质和20克的低分子物质，低分子物质中有多种电解质和有机化合物，血细胞包括红细胞和白细胞和血小板三类细胞。红细胞平均寿命为120天，白细胞寿命为9
‑
13天，血小板寿命为8
‑
9天。血液的功能包含血细胞功能和血浆功能两部分，有运输、调节人体温度、防御、调节人体渗透压和酸碱平衡四个功能。
[0003]随着生物技术的发展，对血液样本分离和冷冻保存，在有需要时进行解冻回输已经成为一种治疗疾病的重要手段。血液样品的分离和冷冻也已经成为一项成熟的技术。但是目前临床研究中，血液样品分离较为单一，通常以分离血清和血浆为主，无法满足实际治疗需要。如何建立高质量的血液样品分离方法仍属于本行业亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种血液样本分离和冻存的方法，分离获得多种血液样本，保证样本的质量。
[0005]本专利技术提供了一种血液分离方法，包括如下步骤：
[0006]将待分离血液分别进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血；
[0007]对部分抗凝血进行第一离心，得血浆、白膜层液体和少浆血；
[0008]将部分抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液混合，第二离心获得单个核细胞；
[0009]对所述促凝血进行第三离心，得血清和血凝块。
[0010]优选的，所述第一离心的温度为4℃，转速为1200g，时间为10min。
[0011]优选的，提取所述单个核细胞时，所述抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液的体积比为3:2:1。
[0012]优选的，所述第二离心包括升速1～2g，降速0～2g，600g离心20min后，抽取混合液中的白膜层，升速4～6g，降速1～3g，600g离心10min。
[0013]优选的，所述第三离心的转速为1600g，时间为10min。
[0014]本专利技术提供了一种血液样本冻存方法，包括如下步骤：
[0015]将上述技术方案所述分离方法得到的单个核细胞与冻存液混合，4℃保温10min后进行变温处理；
[0016]所述变温处理依次包括：以1℃/min的速率降温至
‑
9℃，以50℃/min的速率降温至
‑
50℃，以25℃/min的速率升温至
‑
25℃，以1℃/min的速率降温至
‑
50℃，以10℃/min的速率降温至
‑
90℃；
[0017]将上述技术方案所述血液分离方法得到的血浆、白膜层液体、少浆血、血清层和凝血块层分别放入液氮中浸泡20～30s，
‑
80℃冻存；
[0018]将剩余部分的抗凝血放入液氮中浸泡20～30s，
‑
80℃冻存。
[0019]优选的，按照体积百分含量计，所述冻存液包括10％二甲基亚砜、70％基础培养基和20％血清。
[0020]优选的，按照体积百分含量计，所述冻存液包括70％基础培养基、20％血清、余量的二甲基亚砜和乙二醇。
[0021]优选的，所述二甲基亚砜和乙二醇的体积比为5～7：3～5。
[0022]本专利技术提供了一种血液样本分离方法，分别对抗凝血和促凝血进行处理，能够获得抗凝血(即全血)、血浆、白膜层液体、少浆血、血清层和血凝块，包含全血样本，细胞样本和核酸样本，丰富了样本种类。
[0023]本专利技术通过对分离得到的不同血液样品进行冻存，配置冻存液设计冻存程序，保证了血液样品的质量。实施例结果表明，利用复苏后全血提取DNA，OD
260
/OD
280
的值在1.7～1.9，无蛋白污染且不会发生降解，DNA纯度好；单个核细胞复苏后活率范围为89％～92％，细胞数的范围是(2.9～4.1)
×
106个。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种血液分离方法，包括如下步骤：
[0025]将待分离血液分别进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血；
[0026]对部分抗凝血进行第一离心，得血浆、白膜层液体和少浆血；
[0027]将部分抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液混合，第二离心获得单个核细胞；
[0028]对所述促凝血进行第三离心，得血清和血凝块。
[0029]本专利技术对所述待分离血液的来源并没有特殊限定，优选包括外周血。本专利技术优选分别对待分离血液进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血。本专利技术所述抗凝处理优选包括将抽离得到的血液置于抗凝采血管中；所述促凝处理优选包括将抽离得到的血液置于促凝采血管中。本专利技术所述抗凝采血管购买自碧迪医疗器械(上海)有限公司，促凝采血管购买自碧迪医疗器械(上海)有限公司。本专利技术经抗凝处理得到的抗凝血可以直接用于血液样品DNA的提取。本专利技术为方便进行抗凝处理，特将抽离得到的血液分别放置在三组抗凝采血管中，分别命名为第一抗凝血、第二抗凝血和第三抗凝血。本专利技术所述抗凝采血管的规格优选为5mL。本专利技术对每组抗凝采血管中放置的血液体积不作严格要求，保证体积足够进行后续分离即可。本专利技术在具体实施过程中，优选抽取10mL血液，放置在三组抗凝采血管中，第一抗凝血体积优选为3mL，第二抗凝血体积优选为3mL，第三抗凝血体积优选为4mL，进行后续的实验。
[0030]在本专利技术中，所述第一抗凝血用于全血样本中DNA的提取。
[0031]得所述第二抗凝血后，本专利技术对所述第一抗凝血进行第一离心。本专利技术所述第一离心的温度优选为4℃；所述第一离心的转速优选为1200g；所述第一离心的时间优选为10min。本专利技术进行所述第一离心后，第二抗凝血分为3层，依次为上层血浆层、中间层白膜层和下层少浆层。本专利技术优选分别抽取血浆层、白膜层和少浆层的液体，得血浆、白膜层液体和少浆血。本专利技术对抽取血浆层的方式没有严格要求，保证抽取过程中不接触白膜层即可。本专利技术所述白膜层液体包含少量的血浆、全部中间白膜层和少量的少浆血。本专利技术分别得到血浆、白膜层液体和少浆血，所述血浆能够直接用于后续分子检测，所述白薄层液体能
够直接用于后续分子检测，所述少浆血能够直接用于后续血液常规检测。
[0032]得所述第三抗凝血后，本专利技术将所述第三抗凝血、PBS和淋巴细胞分离液混合，第二离心获得单个核细胞。本专利技术所述第三抗凝血和PBS的体积比优选为3:2；所述第三抗凝血和PBS的体积和与所述淋巴细胞分离液的体积比优选为2:1。本专利技术所述细胞分离液购自Axis
‑
Shield，AS1114546。本专利技术优选将利用PBS稀释后的第三抗凝血沿着装有淋巴细胞分离液容器的容积壁缓慢加入本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血液分离方法，其特征在于，包括如下步骤：将待分离血液分别进行抗凝处理和促凝处理，得抗凝血和促凝血；对部分抗凝血进行第一离心，得血浆、白膜层液体和少浆血；将部分抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液混合，第二离心获得单个核细胞；对所述促凝血进行第三离心，得血清和血凝块。2.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述第一离心的温度为4℃，转速为1200g，时间为10min。3.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，提取所述单个核细胞时，所述抗凝血与PBS和淋巴细胞分离液的体积比为3:2:1。4.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述第二离心包括升速1～2g，降速0～2g，600g离心20min后，抽取混合液中的白膜层，升速4～6g，降速1～3g，600g离心10min。5.根据权利要求1所述分离方法，其特征在于，所述第三离心的转速为1600g，时间为10min。6.一种血液样本冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1～5任一项所述分离方法得到的单个核细胞与冻存液混合，4℃保温10min后进行变温处理；所述变温处理依次包...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘中民，赵庆辉，汤红明，许啸，黎李平，
申请(专利权)人：上海市东方医院同济大学附属东方医院，
类型：发明
国别省市：