一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法。如下步骤：制作固态纳米孔薄膜；将固态纳米孔薄膜作为分隔电解池的正极和负极的隔膜，得到纳米孔测序装置；采用纳米孔测序装置进行检测；将待测的单分子加入至电解池的负极接地腔室中；测试时，在隔膜的两端施加直流电压，通过导电层引入交流电压，分别对单分子提供电场力和介电泳力，分别作为单分子穿过固态纳米孔薄膜中纳米孔的驱动外场和停留在纳米孔内的捕捉力；通过控制介电泳力大于或近似等于电场力以实现对单分子的减速或捕获。本发明专利技术利用介电泳，拓展了纳米孔待测物的测量范围，并可实现对单分子的实时可控捕捉、减速穿孔，极大提升探测时间分辨率。探测时间分辨率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法


[0001]本专利技术涉及一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法，属于纳米孔单分子探测


技术介绍

[0002]基于固态纳米孔器件的DNA单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低成本人类基因测序(在24小时内花费1000美元以下实现单个人的基因组测序)的技术路线之一，是目前研究和应用探索的热点。从2009年，Clarke.J等人发现解旋酶修饰的MspA生物孔可以实现DNA的测序(Nature Nanotech.4,265
–
270,2009)，到2021年牛津纳米孔公司上市，生物纳米孔已经基本实现了DNA的测序。但还有一些问题没有解决：解旋酶工作在未知原因状态下失效导致错误率，生物孔大小不易调节导致的待测物尺寸限制；在一些相对极端的环境中不易保存；与现代半导体工艺不兼容导致的成本高等。但对于固态纳米孔来说，可以控制孔的大小；孔也可以承受范围更广的温度，酸碱度，易保存；与半导体工艺兼容，可以量产这些优势，继续推动固态纳米孔测序技术的前进是非常有前景且具有重大意义的。
[0003]通过在溶液中电泳驱动分子穿过一个纳米尺度的孔可以实现基于纳米孔器件的单分子探测和分析能力。在纳米孔的有限空间里可以通过各种手段对大量分子进行快速的分析，当高聚物分子穿过纳米孔时，高聚物分子的结构信息和探测的信号特征有一一对应关系。利用该特性可以直接对数千碱基对长度的单链DNA分子进行表征，避免了扩增或标记实验准备环节，使得快速低成本DNA测序技术成为可能。目前阻碍这一技术长足发展的最大困难在于在电场驱动电压下，DNA穿孔速度过快，超出了通用仪器的时间分辨率，从而无法实现对单碱基的差别进行识别。如何利用固态纳米孔对DNA分子进行捕获，对于研究溶液中对单分子的捕获，操纵，控制，并且研究其化学转化、分子内部动态变化等生物学过程具有非常重要的实际意义。
[0004]目前国际上较为常用的实验技术是在纳米孔两端加一个电压，通过电场驱动，使DNA分子从孔一端电泳通过纳米孔，在外电路收集的离子电流会出现一个突然下降，电流的突然下降值和阻滞时间，可以对应DNA的生物学信息。但是单纯使用电场调节，DNA的穿孔速度太快，基本在一个碱基一微秒的量级，而目前仪器的最小分辨率为4微秒，也就是说，如果想要区别不同碱基之间的差别，通过现有手段，其时间分辨率是无法达到的。要提高时间分辨率，就必须使DNA分子的穿孔时间延长，有效减慢DNA在孔中的运动速度。减慢DNA的穿孔速度，才有可能实现对不同碱基的分辨。
[0005]另一方面，现有的第二代高通量测序技术的基本原理是将待测物种的全基因组随机打碎成数百bp的小片段，然后经过体外扩增和修饰标定之后，利用一种“边合成边测序”的方法读取每一个小片段的序列，最后将全部小片段的序列通过一定的算法整合在一起，还原出全基因组的序列。需要指出的是，每个数百bp的小片段相对于人类的全基因组(约3
×
109bp)来说实在太小，因此在小片段的比对和拼接环节的计算量和算法复杂度是极高
的，而且由于人类基因组中存在大量的重复序列，导致现有算法得出的全基因组仍然有5％～10％的不确定度；因此对于精确度要求很高的医疗诊断、药物筛选以及高端科研领域，需要对整个序列进行十几甚至上百次的重复测序，无疑大大增加了测序的成本且降低了时间效率。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种基于纳米孔器件利用介电泳技术对DNA实现实时可控捕捉的方法，可实现对单分子(如：DNA、肽链等)的实时可控捕捉、减速穿孔的方法，极大地提升探测时间分辨率。
[0007]本专利技术涉及的介电泳，是电介质在非均匀电场中受力的现象。所有物体都是电介质，这种非均匀电场可以诱导出有限大小的物体的偶极矩，从而在非均匀电场中受力。这一力的存在不需要物体本身带电，力的大小同时取决于物质的介电性质，形状，大小以及场强的变化频率。介电泳在分离不同大小，分子量的生物分子中已有许多应用，并且这种力不会使生物分子变性。在纳米孔器件中如果引入合适的介电泳力，与电场力平衡，即可以大幅降低DNA分子的穿孔速度，提高探测时间分辨率，此外还可以实现对于单分子的捕获和操控。
[0008]本专利技术提供的基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法，包括如下步骤：
[0009]S1、制作固态纳米孔薄膜；所述固态纳米孔薄膜包括依次复合的绝缘层Ⅰ、导电层和绝缘层Ⅱ；
[0010]S2、制作纳米孔测序装置；将所述固态纳米孔薄膜作为分隔电解池的正极和负极的隔膜，得到所述纳米孔测序装置；
[0011]S3、采用所述纳米孔测序装置进行检测；将待测的单分子加入至所述电解池的负极接地腔室中；测试时，在所述隔膜的两端施加直流电压，通过所述导电层引入交流电压，分别对所述单分子提供电场力和介电泳力，分别作为所述单分子穿过所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的驱动外场和停留在所述纳米孔内的捕捉力；通过控制所述介电泳力大于或近似等于所述电场力，实现对所述单分子的减速或捕获；
[0012]其中，所述电场力可以使单分子从孔一端电泳通过纳米孔，作为DNA穿孔的驱动外场；所述介电泳力可以使DNA分子被捕捉在固态纳米孔内；
[0013]通过检测正负极外电路的离子电流可以判断单分子如DNA分子是否被捕捉在纳米孔内。
[0014]上述的方法中，所述固态纳米孔薄膜中，所述绝缘层Ⅰ为氮化硅薄膜，厚度为20～50nm；所述导电层为钛金薄膜，厚度为5～10nm；所述绝缘层Ⅱ为三氧化铝薄膜，厚度为1～20nm。
[0015]上述的方法中，所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的直径为5～30nm，孔深为50～80nm。
[0016]上述的方法中，测试时，所述电解池中盛放有电解液，所述电解液为NaCl溶液、KCl溶液或LiCl溶液；
[0017]所述电解液的浓度为0.1～3.2mol/L，pH值为7～10。
[0018]上述的方法中，所述直流电压为0～1V；
[0019]所述交流电压的峰值为0～1V，频率为0.5～2MHz；
[0020]经过有限次试验可确定使DNA穿孔速度降低所施加的最佳电压和频率。
[0021]基于上述方法，还可以解决DNA测序中时间分辨率过低的问题，即提供了一种对DNA进行测序的方法。采用本专利技术的方法对DNA进行检测，确定了使DNA穿孔速度降低所施加的最佳电压和频率后，适当加大直流电压从而控制DNA穿孔的速度，从而解决DNA在固态孔测序中时间分辨率过低的问题。
[0022]本专利技术突破传统的基于固态纳米孔器件的DNA测序的方法，引入介电泳作为捕获DNA的外场，同时可以调整电场力和介电泳力的相对大小来控制DNA的穿孔速度，在不降低测量信号信噪比的前提下，使用直径10nm左右的SiN固态纳米孔，有效降低DNA分子穿过纳米孔器件的速度。显著提高了现有工作的时间分辨率，既可以保持高的电流信号信噪比，又可以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米孔器件利用介电泳力对单分子进行减速和/或捕获的方法，包括如下步骤：S1、制作固态纳米孔薄膜；所述固态纳米孔薄膜包括依次复合的绝缘层Ⅰ、导电层和绝缘层Ⅱ；S2、制作纳米孔测序装置；将所述固态纳米孔薄膜作为分隔电解池的正极和负极的隔膜，得到所述纳米孔测序装置；S3、采用所述纳米孔测序装置进行检测；将待测的单分子加入至所述电解池的负极接地腔室中；测试时，在所述隔膜的两端施加直流电压，通过所述导电层引入交流电压，分别对所述单分子提供电场力和介电泳力，分别作为所述单分子穿过所述固态纳米孔薄膜中纳米孔的驱动外场和停留在所述纳米孔内的捕捉力；通过控制所述介电泳力大于或近似等于所述电场力，实现对所述单分子的减速或捕获。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固态纳米孔薄膜中，所述绝缘层Ⅰ为氮化硅薄膜，厚度为20～50nm；所述导电层为钛金薄膜，厚度为5～10nm；所述绝缘层Ⅱ为三氧化铝薄膜，厚度为1～20nm。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵清，魏广昊，胡蕊，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：