去表位的α-麦醇溶蛋白及其在乳糜泻和麸质敏感性管理中的用途制造技术

提供了一种去表位的α

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】去表位的
α
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麦醇溶蛋白及其在乳糜泻和麸质敏感性管理中的用途
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2019年7月4日提交的美国临时专利申请第62/870,695号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
[0003]序列表陈述
[0004]与本申请同时提交的题为83105Sequence Listing.txt的ASCII文件，创建于2020年6月30日，包含58,437个字节，通过引用并入本文。

技术介绍

[0005]本专利技术在其一些实施例中涉及对α
‑
麦醇溶蛋白进行去表位的方法及其在包括乳糜泻的麸质敏感性管理中的用途。
[0006]乳糜泻(CD)是一种发病于易感个体(许多个体具有HLA基因型DQ2或DQ8)的获得性慢性免疫疾病，其与环境因素麸质有关，麸质是小麦和相关谷物如黑麦和大麦的储存蛋白。据估计，在欧洲和美国，乳糜泻的患病率约站人口的1至2％。乳糜泻具有广泛的临床表现，包括潜伏性或无症状乳糜泻、仅伴有轻度胃肠紊乱的疾病、慢性胃肠症状、吸收不良和/或体重减轻。乳糜泻通常在患有孤立性缺铁性贫血的患者中诊断出来。
[0007]摄入含有麸质的谷类食品也可能会引发肠外症状，如骨质疏松症、外周和中枢神经系统受累、轻度或重度肝病、不孕不育问题，并且典型实例是麸质诱发的皮肤病、疱疹样皮炎。
[0008]对于患有乳糜泻的患者，需要严格遵守终身完全不摄入麸质，以避免显著增加发展进一步并发症的风险，如骨骼疾病、不孕不育症和癌症。乳糜泻患者的死亡率超过普通人群；然而，在食用无麸质饮食1至5年后，死亡率有下降的趋势。
[0009]然而，遵循完全不含麸质的饮食是非常具有挑战性的。即使是努力保持严格的饮食方案的高度积极性的病人，也会由于无意中或在背景下接触到麸质而受到影响。多达80％的处于临床缓解期并声称遵循无麸质饮食的乳糜泻患者在小肠活检标本中仍具有持续的异常。在临床诊断的假定无麸质饮食的患者中，无意中接触到麸质已被确定为无反应性乳糜泻的主要原因。
[0010]总之，迫切需要更多的乳糜泻饮食疗法，这些疗法既不昂贵又容易获得。
[0011]S
á
nchez
‑
Le
ó
n,Susana等人《用CRISPR/Cas9基因工程的低麸质非转基因小麦(Low
‑
gluten,Nontransgenic Wheat Engineered with CRISPR/Cas9)》《植物生物技术杂志(Plant Biotechnology Journal)》16.4(2018)：902
‑
910。PMC。
[0012]其它
技术介绍
包括美国专利申请第20160338366号。
[0013]其它
技术介绍
包括Herpen等人，《BMC基因组学(BMC Genomics)》第7卷，文章号：1(2006)；Kumar等人，第319卷，第3期，2002年6月7日，第593至602页；Ozuna等人，《植物杂志(The Plant Journal)》(2015)82，794
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805；Petersen等人，《自然结构与分子生物学(Nature Structural&Molecular Biology)》第21卷，第480至488页(2014)；Mitea等人，《公
共科学图书馆期刊(PLoS One)》。2010；5(12):e15637；Qiao等人，《免疫学杂志(J Immunol)》2011；187:3064
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3071

技术实现思路

[0014]根据本专利技术的一方面，提供了一种对α
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麦醇溶蛋白进行去表位的方法，α
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麦醇溶蛋白包含具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：91)和/或PLPYPQP(SEQ ID NO：92)所示的氨基酸序列的抗原单元，该方法包含用选自由带正电荷的氨基酸、脯氨酸和脂肪族氨基酸组成的组的氨基酸取代抗原单元的位置1处的氨基酸残基；以及在抗原单元的位置4或5处再取代至少一个氨基酸残基，从而生成去表位的α
‑
麦醇溶蛋白。
[0015]根据本专利技术的一方面，提供了一种生成去表位的α
‑
麦醇溶蛋白的方法，该方法包含在α
‑
麦醇溶蛋白的氨基酸57和氨基酸89之间的位置突变一个或多个氨基酸残基，其中突变中的至少一个在选自由63、64、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83和84组成的组中的位置的氨基酸上实现，从而生成去表位的α
‑
麦醇溶蛋白，其中突变的位置根据SEQ ID NO：32中所示的野生型α
‑
麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
[0016]根据本专利技术的一方面，提供了一种去表位的α
‑
麦醇溶蛋白，其包含：
[0017](i)用选自由带正电荷的氨基酸、脯氨酸和脂肪族氨基酸组成的组的氨基酸在野生型α
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麦醇溶蛋白的抗原单元的位置1处的取代；以及
[0018](ii)在抗原单元的位置4和/或5处的取代；
[0019]其中抗原单元具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：91)或PLPYPQP(SEQ ID NO：92)所示的氨基酸序列。
[0020]根据本专利技术的一方面，提供了一种去表位的α
‑
麦醇溶蛋白，其在α
‑
麦醇溶蛋白的氨基酸57和氨基酸89之间的位置包含至少一个或多个突变，其中突变中的至少一个在选自由63、64、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83和84组成的组中的位置的氨基酸上实现，其中突变的位置根据SEQ ID NO：32中所示的野生型α
‑
麦醇溶蛋白的氨基酸序列。
[0021]根据本专利技术的一方面，提供了一种编码本文描述的去表位的α
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麦醇溶蛋白的分离的多核苷酸。
[0022]根据本专利技术的一方面，提供了一种包含本文描述的分离的多核苷酸的表达载体，其可操作地连接到转录调节序列以允许α
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麦醇溶蛋白在植物细胞中表达。
[0023]根据本专利技术的一方面，提供了一种包含本文描述的去表位的α
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麦醇溶蛋白的细胞。
[0024]根据本专利技术的一方面，提供了一种生成去表位的α
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麦醇溶蛋白的方法，其包含在允许去表位的α
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麦醇溶蛋白在细胞中表达的条件下，培养包含本文所述表达载体的细胞，从而生成去表位的α
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麦醇溶蛋白。
[0025]根据本专利技术的一方面，提供了一种源自非麸质植物的面粉，其包含本文描述的去表位α。
[0026]根据本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种对α
‑
麦醇溶蛋白进行去表位的方法，所述α
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麦醇溶蛋白包含具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：91)和/或PLPYPQP(SEQ ID NO：92)所示的氨基酸序列的抗原单元，所述方法包含用选自由带正电荷的氨基酸、脯氨酸和脂肪族氨基酸组成的组的氨基酸取代所述抗原单元的位置1处的氨基酸残基；以及在所述抗原单元的位置4或5处再取代至少一个氨基酸残基，从而生成去表位的α
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麦醇溶蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述去表位的α
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麦醇溶蛋白不包含以小于30μM的IC50与MHC类型DQ2或DQ8结合的15聚体肽。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述去表位的α
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麦醇溶蛋白包含如SEQ ID NO：60至80所示的氨基酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述去表位的α
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麦醇溶蛋白包含如SEQ ID NO：49至58所示的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述取代在所述抗原单元的至少两个上进行。6.根据权利要求1所述的方法，其中所述取代在所述抗原单元的至少三个上进行。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法包含在所述抗原单元的位置1、4和5处取代所述氨基酸残基。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在所述抗原单元的位置1处的所述取代包含用带正电荷的氨基酸进行的替换。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述带正电荷的氨基酸是组氨酸或赖氨酸。10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在所述抗原单元的位置4处的所述取代包含用脯氨酸、脂肪族氨基酸、极性氨基酸或甘氨酸的取代。11.根据权利要求10所述的方法，其中在位置4处的所述取代包含用脯氨酸进行的替换。12.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在所述抗原单元的位置5处的所述取代包含用小氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸进行的替换。13.根据权利要求12所述的方法，其中在位置5处的所述取代包含用小氨基酸进行的替换。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述小氨基酸包含甘氨酸或丝氨酸。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其进一步包含用芳香族或极性氨基酸取代所述抗原单元的位置3处的所述氨基酸残基。16.一种生成去表位的α
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麦醇溶蛋白的方法，所述方法包含在所述α
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麦醇溶蛋白的氨基酸57和氨基酸89之间的位置突变一个或多个氨基酸残基，其中突变中的至少一个在选自由63、64、66、68、69、70、72、73、75、76、77、78、80、81、82、83和84组成的组中的位置的氨基酸上实现，从而生成所述去表位的α
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麦醇溶蛋白，其中所述突变的位置根据SEQ ID NO：32中所示的野生型α
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麦醇溶蛋白的氨基酸序列。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述去表位不降低所述α
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麦醇溶蛋白的变应原性。18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述α
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麦醇溶蛋白包含与SEQ ID NO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示的序列至少50％相同的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述α
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麦醇溶蛋白包含与SEQ ID NO：32、81、82、83、84、85、86、87、88或89所示的序列至少80％相同的氨基酸序列。20.根据权利要求16所述的方法，其中所述突变选自由P63D/W、Q64H、Q66R/K/H/M、P68S/R、Y69W/G、P70S、P72G、Q73W/R、P75R、Y76G、P77S、Q78H、Q80R/W、L81S、P82R、Y83G和P84T/M组成的组。21.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述α
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麦醇溶蛋白的至少一个谷氨酰胺突变为谷氨酸。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述位置选自由66、73和/或80组成的组，其中所述突变的所述位置根据SEQ ID NO：32所示的野生型α
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麦醇溶蛋白的氨基酸序列。23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述去表位的α
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麦醇溶蛋白与源自乳糜泻患者的T细胞的结合亲和力低于对应的未突变α
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麦醇溶蛋白与源自所述乳糜泻患者的T细胞的结合亲和力。24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中如使用基于HLA
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DQ
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肽四聚体的测定或通过干扰素
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γELISA测定所测量的，所述去表位的α
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麦醇溶蛋白激活源自乳糜泻患者的T细胞的程度小于对应的未突变α
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麦醇溶蛋白激活源自所述乳糜泻患者的T细胞。25.根据权利要求23所述的方法，其中所述亲和力降低至少约10％。26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述去表位不破坏多肽的三维结构。27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述去表位不破坏所述多肽的折叠。28.一种去表位的α
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麦醇溶蛋白，其包含：(i)用选自由带正电荷的氨基酸、脯氨酸和脂肪族氨基酸组成的组的氨基酸在野生型α
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麦醇溶蛋白的抗原单元的位置1处的取代；以及(ii)在所述抗原单元的位置4和/或5处的取代；其中所述抗原单元具有如QLPYPQP(SEQ ID NO：90)、QLPYSQP(SEQ ID NO：91)或PLPYPQP(SEQ ID NO：92)所示的氨基酸序列。29.根据权利要求28所述的去表位的α
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麦醇溶蛋白，其不包含以小于30μM的IC50与MHC类型DQ2或DQ8结合的15聚体肽。30.根据权利要求28或29所述的去表位的α
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麦醇溶蛋白，其包含如SEQ ID NO：60至80所示的氨基酸序列。31.根据权利要求28至30中任一项所述的去表位的α
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麦醇溶蛋白，其包含如SEQ ID NO：49至57所示的氨基酸序列。32.根据权利要求28至30中任一项所述的去表位的α
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麦醇溶蛋白，其包含在所述抗原单元的至少两个上的取代。33.根据权利要求28至30中任一项所述的去表位的α
‑
麦醇溶蛋白，其包含在所述抗原单元的至少三个上的取代。34.根据权利要求28至29中任一项所述的去表位的α
‑
麦醇溶蛋白，其包含在所述抗原单元的位置1、4和5处的取代。35.根据权利要求28至29中任一项所述的去表位的α
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麦醇溶蛋白，其中所述抗原单元
的位置1处的所述取代包含用带正电荷的氨基酸进行的替换。36.根据权利要求28或29所述的去表位的α
‑
麦醇溶蛋白，其中所述带正电荷的氨基酸是组氨酸或赖氨酸。37.根据权利要求28或29中任一项所述的去表位的α
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麦醇溶蛋白，其中在位置4处的所述取代包含用脯氨酸、脂肪族氨基酸、极性氨基酸或甘氨酸进行的替换。38.根据权利要求37所述的去表位的α
‑
麦醇溶蛋白，其中在位置4处的...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚奈，
申请(专利权)人：乌科公司，
类型：发明
国别省市：