一种基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法技术

一种基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法，包括多个捕获珠、被检测分析物、功能性荧光颗粒和检测芯片；捕获珠表面与被检测分析物具有亲和力，当被检测分析物浓度较低时，基于泊松分布原理，在检测时捕获珠只有一部分能捕获到一个被检测分析物，捕获到被检测分析物的捕获珠又能以一对一的方式结合功能性荧光颗粒，使得捕获到被检测分析物的捕获珠带有荧光；检测时，结合有功能性荧光颗粒的捕获珠与没有功能性荧光颗粒的所有多个捕获珠一起平铺在检测芯片上，形成阵列式排布，通过荧光检测装置对平铺在检测芯片上的所有捕获珠进行荧光识别，实现单分子荧光检测。本发明专利技术使得单分子荧光检测更加简单、精确、高效。高效。高效。

【技术实现步骤摘要】
一种基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法


[0001]本专利技术涉及一种单分子检测方法，尤其是指一种基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法，该种基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法可以有效解决目前单分子检测技术存在检测效率低，操作复杂，成本高的难题，可广泛应用于化学分析、蛋白分析、核酸分析、单细胞分析、外泌体分析、循环肿瘤细胞分析以及单分子反应动力学研究等领域。属于单分子荧光检测


技术介绍

[0002]单分子检测（Single Molecule Detection, SMD）是近年来快速发展起来的一种超灵敏的检测技术，其是指从单分子水平上对目标物进行测定与分析，是一种全新的检测方法，也开辟了一种全新的检测领域。单分子荧光检测是单分子检测最常用的方法 ，通过标记在生物大分子上各个荧光基团的各种特性的变化反映了有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、分子构象、DNA和RNA的转录、蛋白质折叠等生物学信息。单分子荧光检测在化学分析、生物分析、纳米材料分析、医学诊断、法医分析、单细胞分析、分子动力学机理考察等方面都具有独特的应用价值，对许多学科领域的发展产生了和正在产生着深远的影响。单分子荧光检测形式可分为三种：光子爆发检测、单分子图像记录和单分子光谱测绘。光子爆发检测最为简单，直接测定爆发的光子数。单分子成像可指示分子在图像中的位置和发光强弱，实时跟踪记录单分子。其中，美国Quanterix公司研发出一种Simoa（Single
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molecule Array）技术为目前最为先进的单分子荧光检测技术，该技术的灵敏度为ELISA技术的1000倍以上，检测下限达到fg/mL，实现了单分子的有效检测和定量。但是，现有的Simoa技术还存在一些问题，主要有：1、对制造工艺和精度要求较高：Simoa技术使用了接近微米加工体系极限的3μm微孔阵列，加工精度要求高、生产成本高昂；2、需要专门的配套试剂：Simoa技术对于微球的大小和均一程度有着极高的要求，一般粒径要求为2.7μm，尺寸太大的微球会导致其无法进入3μm的微孔，尺寸太小又会导致同一个微孔阵列中落入多个微球；3、检测时间较长：Simoa检测系统单次检测耗时长达1小时以上，远超过目前免疫诊断市场中已经能轻易实现的15分钟报告时间；正是因为存在上述的一些不足，导致Simoa技术的应用推广存在难度，为此很有必要对此加以改进。
[0003]通过查询检索发现有关于单分子检测的相关专利，但未发现与本申请技术方案相同的专利文献报道，相类似的专利文献主要有以下几篇：1、专利号为CN201611001903.7，名称为“单分子检测方法”，申请人为：清华大学；鸿富锦精密工业（深圳）有限公司的专利技术专利，该专利公开了一种单分子检测的装置，包括；一容器，所述容器包括一入口以及一出口；一分子载体，所述分子载体包括一基板以及设置于所述基板表面的金属层；一检测器；以及一控制电脑；其中，所述基板包括一基底以及多
个设置于该基底表面的图案化的凸起，所述图案化的凸起包括多个凸条交叉设置形成网状结构，从而定义多个孔洞；所述金属层设置于所述图案化的凸起的表面。由于金属层设置在图案化的凸起的表面，而图案化的凸起包括多个凸条交叉设置形成网状结构。因此，在外界入射光电磁场的激发下，金属表面等离子体发生共振吸收，而交叉设置的凸条起到表面增强拉曼散射（SERS）的作用，可提高SERS增强因子，从而增强拉曼散射。该专利只是提出对分子载体的改进，并未提出如何解决现有单分子检测所存在的检测时间长的问题。
[0004]2、专利号为CN201510256620.6，名称为“使用珠或其他捕获物对分子或颗粒的超灵敏检测”，申请人为：匡特里克斯公司的专利技术专利申请，该专利申请公开了一种用于检测在流体样品中分析物分子或颗粒，以及在一些情况下确定所述流体样品中分子或颗粒的浓度的量度的系统和方法。本专利技术的方法可包括将多个分析物分子或颗粒固定化于多个捕获物上。将至少一部分的所述多个捕获物在空间上划分入多个位置。流体样品中分析物分子浓度的量度至少部分地基于包含固定化于捕获物的分析物分子的反应容器数而确定。在一些情况下，所述测定可另外包括包含结合配体、前体标记试剂和/或酶组分的步骤。该专利为Simoa技术的核心专利，所以自然存在前面所述的问题。
[0005]3、专利号为CN201780045669.4，名称为“用于单分子检测的阵列及其应用”，申请人为：【美国】卓异生物公司的专利技术专利申请，该专利申请公开了一种产生阵列的方法，所述方法包括：分别确定第一靶探针和第二靶探针与多个捕获探针的杂交效率，其中所述第一靶探针和第二靶探针以及所述多个捕获探针是寡核苷酸探针，所述第一靶探针包含第一标记或序列，所述第二靶探针包含与所述第一标记或序列不同的第二标记或序列；基于所述杂交效率预选择所述多个捕获探针在基板上将要被固定的密度，以及根据所述密度将所述多个捕获探针固定至所述基板，从而在所述基板上产生多个元件。
[0006]4、专利号为CN202110558668.8，名称为“一种用于单分子检测的磁珠及其制备方法”，申请人为：深圳市光与生物科技有限公司的专利技术专利申请，该专利申请公开了一种用于单分子检测的磁珠及其制备方法，所述用于单分子检测的磁珠由磁性氨基取代的聚苯乙烯微球、吡啶化合物、无水醋酸汞、琥珀酰亚胺基碳酸酯修饰的超支化聚缩水甘油醚组装而成；本专利技术首先通过对磁珠表面改性，将氨基引入磁性微珠表面，进而得到具有功能化的磁珠，然后跟吡啶化合物、无水醋酸汞、琥珀酰亚胺基碳酸酯修饰的超支化聚缩水甘油醚反应，得到表面包裹超支化聚缩水甘油醚和吡啶汞配合物改性的羧基磁性微珠，该羧基磁性微珠上的活性基团跟捕获抗体上的氨基反应，同时，吡啶汞配合物的汞金属可以与捕获抗体上的二硫键配位，使捕获抗体与固相载体紧密结合，提高检测的准确性。该专利也只是提出对分子载体检测磁珠进行改进，所以自然存在前面所述的问题。
[0007]上述这些专利虽然都涉及到了单分子检测方法，也涉及到了相关的检测设备，其中专利CN201510256620.6为Simoa技术的核心专利，但是现有的技术都未能有效解决单分子检测时间较长、对制造工艺和精度要求较高的难题，这样前面所述的问题仍然存在，所以很有必要对此加以改进。

技术实现思路

[0008]本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的单分子检测目前所存在的不足，提供一种新的基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法。通过对现有单分子
检测方法的改进，在满足现有检测的精确度的同时，大幅缩短检测时间，提升检测效率，并有效降低检测设备的制造难度。
[0009]本专利技术主要通过以下技术方案实现的：一种基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法，包括多个捕获珠、被检测分析物、功能性荧光颗粒和检测芯片；捕获珠表面与被检测分析物具有亲和力，在检测时捕获珠只有有一部分能捕获到被检测分析物，捕获到被检测分析物的捕获珠又能以一对一的方式结合功能性荧光颗粒，使得捕获到被检测分析物的捕获珠带有荧光；检测时，结合有功能性荧光颗粒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法，其特征在于：包括多个捕获珠、被检测分析物、功能性荧光颗粒和检测芯片；捕获珠表面与被检测分析物具有亲和力，当被分析物浓度较低时，基于泊松分布原理，在检测时捕获珠中只有一部分能捕获到单个被检测分析物，捕获到被检测分析物的捕获珠又能以一对一的方式结合功能性荧光颗粒，使得捕获到被检测分析物的捕获珠带有荧光；检测时，结合有功能性荧光颗粒的捕获珠与没有功能性荧光颗粒的所有多个捕获珠一起平铺在检测芯片上，形成阵列式排布，通过荧光检测装置对平铺在检测芯片上的所有捕获珠进行荧光识别，并通过荧光识别进行单分子荧光检测。2.如权利要求1所述的基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法，其特征在于：所述的捕获珠指带有磁性的磁珠；在捕获珠的表面上包被有与被检测分析物具有亲和力的物质，使得捕获珠在检测时能够捕获到被检测分析物。3.如权利要求2所述的单分子荧光检测方法，其特征在于：所述的磁珠包括超顺磁性纳米微球，磁珠必须要具备超强的顺磁性，即在磁场的存在下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集显现现象。4.如权利要求1所述的基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法，其特征在于：所述的被检测分析物包括化学分析、蛋白分析、核酸分析、细胞分析、外泌体分析、循环肿瘤细胞分析、纳米材料分析等各种被检测分析物质分子，可用于精准医疗、法医鉴定、食品安全以及环境保护领域。5.如权利要求4所述的基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法，其特征在于：所述的被检测分析物包括各种核酸、蛋白质、外泌体、循环肿瘤细胞和小分子物质。6.如权利要求1所述的基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法，其特征在于：所述的功能性荧光颗粒包括硅颗粒、量子点、上转换荧光纳米颗粒以及包被有有机小分子染料等荧光物质的荧光颗粒。7.如权利要求1所述的基于光栅与磁阵列式的单分子荧光检测方法，其特征在于：所述的检测芯片为带有磁性阵列的磁阵列芯片，在检测芯片上按照阵列分布有磁源，使得捕获磁珠落在芯片上将自动按照芯片的阵列进行隔离排布。8.如权利要求7所述的基于光栅与磁阵...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢成昆，陈小洪，何峰，杨梅，
申请(专利权)人：湖南超亟检测技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：