一种细胞玻璃化解冻液、制备方法及冷冻细胞的解冻方法技术

本发明专利技术涉及细胞解冻技术领域，尤其涉及一种细胞玻璃化解冻液、制备方法及冷冻细胞的解冻方法。具体包括解冻液、稀释液1、稀释液2和清洗液；所述解冻液包括：基础液+蛋白添加物+半乳糖+谷胱甘肽+海藻糖；所述稀释液1包括：基础液+蛋白添加物+半乳糖+谷胱甘肽+海藻糖；所述稀释液2包括：基础液+蛋白添加物+半乳糖+谷胱甘肽+海藻糖；所述清洗液包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物。本发明专利技术所述玻璃化解冻液不含蔗糖等具有潜在毒性的组分，且解冻后的细胞存活率高。率高。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞玻璃化解冻液、制备方法及冷冻细胞的解冻方法


[0001]本专利技术涉及细胞解冻
，尤其涉及一种细胞玻璃化解冻液、制备方法及冷冻细胞的解冻方法。

技术介绍

[0002]“玻璃化”的概念是指水或者溶液快速降温达到或低于
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110～
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100℃的温度范围时，形成一种高黏度的介于液态和固态之间、非晶体的、透明的玻璃态。因此，玻璃化冷冻技术的基本原理就是用高浓度的解冻保护剂溶液将细胞内水分置换出来，经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体状固体状态，这一状态的变化无冰晶形成，避免了冰晶形成对细胞脂质膜及细胞骨架结构的损伤，而玻璃化解冻技术就是一种逆转玻璃化冷冻的过程，通过利用浓度逐级递减的保护剂溶液，将冷冻过程中进入细胞内的冷冻保护剂用水替换出来，并在解冻、替换的过程中无冰晶损伤。
[0003]近些年来，玻璃化解冻技术获得了很大的进步，冻融后存活率得到了较大的提高。而现有技术中记载的解冻液当中，还存在的一些问题，如蔗糖的添加会有一定的潜在毒性。但蔗糖等组分的使用确实提高了细胞解冻后的存活率，所以，含有蔗糖等组分的解冻液依然是人们的主要选择。
[0004]因此，如何提供一种安全且解冻存活率高的细胞玻璃化解冻液，以解决现有技术当中的解冻液存在潜在毒性危险的技术问题，是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种细胞玻璃化解冻液、制备方法及冷冻细胞的解冻方法。本专利技术所述玻璃化解冻液不含蔗糖等具有潜在毒性的组分，且解冻后的细胞存活率高。
[0006]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种细胞玻璃化解冻液，包括解冻液、稀释液1、稀释液2和清洗液；
[0008]所述解冻液包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物+9～11mg/ml半乳糖+8～12mg/ml谷胱甘肽+4～7mol/ml海藻糖；
[0009]所述稀释液1包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物+9～11mg/ml半乳糖+7～11mg/ml谷胱甘肽+3～6mol/ml海藻糖；
[0010]所述稀释液2包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物+9～11mg/ml半乳糖+6～10mg/ml谷胱甘肽+2～4mol/ml海藻糖；
[0011]所述清洗液包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物。
[0012]优选的，所述基础液为改良的人输卵管液、M199或平衡盐溶液PBS。
[0013]优选的，所述蛋白添加物为人血清白蛋白或血清替代物。
[0014]优选的，所述解冻液、稀释液1、稀释液2和清洗液的pH值独立为7.2～7.8。
[0015]优选的，所述解冻液、稀释液1、稀释液2和清洗液的渗透压独立为600～700mOsm/Kg。
[0016]本专利技术还提供了一种细胞玻璃化解冻液的制备方法，所述解冻液、稀释液1和稀释液2的制备方法独立为：将蛋白添加物、半乳糖、谷胱甘肽和海藻糖依次加入基础液中混合；
[0017]所述清洗液的制备方法为：将基础液和蛋白添加物混合。
[0018]本专利技术还进一步提供了一种冷冻细胞的解冻方法，包括如下步骤：
[0019](1)将解冻液、稀释液1、稀释液2和清洗液预热；
[0020](2)将待解冻细胞依次浸入所述细胞玻璃化解冻液的解冻液中2～5min、稀释液1中3～6min、稀释液2中2～5min、清洗液中4～8min。
[0021]优选的，所述待解冻细胞为精细胞或卵母细胞。
[0022]优选的，所述预热的温度为37.2～37.5℃。
[0023]与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
[0024]1、单纯的谷胱甘肽对细胞膜的保护能力差，而本专利技术将谷胱甘肽与海藻糖进行复配，可提高海藻糖谷胱甘肽对细胞膜的保护能力，并且，海藻糖可以有效地阻止解冻过程中水的内流速度，防止冰晶的形成。
[0025]2、本专利技术所述玻璃化解冻液可以提高细胞中细胞膜的稳定性，最大限度降低解冻过程中出现的冷冻损伤。最终本专利技术的玻璃化解冻液可显著提高卵细胞的存活率和受精率，并提高精细胞的存活率和顶体完整率。本专利技术成分简单，成本低廉，具有良好的应用前景。
具体实施方式
[0026]本专利技术提供了一种细胞玻璃化解冻液，包括解冻液、稀释液1、稀释液2和清洗液；
[0027]所述解冻液包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物+9～11mg/ml半乳糖+8～12mg/ml谷胱甘肽+4～7mol/ml海藻糖；优选为基础液+3～7mg/ml蛋白添加物+10mg/ml半乳糖+9～11mg/ml谷胱甘肽+5～6mol/ml海藻糖；进一步优选为：基础液+4～6mg/ml蛋白添加物+10mg/ml半乳糖+10mg/ml谷胱甘肽+5.5mol/ml海藻糖。
[0028]所述稀释液1包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物+9～11mg/ml半乳糖+7～11mg/ml谷胱甘肽+3～6mol/ml海藻糖；优选的包括：基础液+3～7mg/ml蛋白添加物+10mg/ml半乳糖+8～10mg/ml谷胱甘肽+4～5mol/ml海藻糖；进一步优选为基础液+4～6mg/ml蛋白添加物+10mg/ml半乳糖+9mg/ml谷胱甘肽+4.5mol/ml海藻糖。
[0029]所述稀释液2包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物+9～11mg/ml半乳糖+6～10mg/ml谷胱甘肽+2～4mol/ml海藻糖；优选的包括：基础液+3～7mg/ml蛋白添加物+10mg/ml半乳糖+7～9mg/ml谷胱甘肽+3mol/ml海藻糖；进一步优选为基础液+4～6mg/ml蛋白添加物+10mg/ml半乳糖+8mg/ml谷胱甘肽+3mol/ml海藻糖。
[0030]所述清洗液包括基础液+2～8mg/ml蛋白添加物；优选的包括：基础液+3～7mg/ml蛋白添加物；进一步优选为基础液+4～6mg/ml蛋白添加物。
[0031]在本专利技术具体实施过程中，所述细胞玻璃化解冻液更优选的组成如下：解冻液为：基础液+5mg/ml蛋白添加物+10mg/ml半乳糖+10mg/ml谷胱甘肽+5.5mol/ml海藻糖；稀释液1为：基础液+5mg/ml蛋白添加物+10mg/ml半乳糖+9mg/ml谷胱甘肽+4.5mol/ml海藻糖；稀释液2为：基础液+5mg/ml蛋白添加物+10mg/ml半乳糖+8mg/ml谷胱甘肽+3mol/ml海藻糖；清洗液为：基础液+5mg/ml蛋白添加物。
[0032]在本专利技术中，所述基础液为改良的人输卵管液、M199或平衡盐溶液PBS；优选为M199或平衡盐溶液PBS；进一步优选为平衡盐溶液PBS。
[0033]在本专利技术中，所述蛋白添加物为人血清白蛋白或血清替代物；优选为血清替代物。
[0034]在本专利技术中，所述解冻液、稀释液1、稀释液2和清洗液的pH值独立为7.2～7.8；优选为7.3～7.7；进一步优本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞玻璃化解冻液，其特征在于，包括解冻液、稀释液1、稀释液2和清洗液；所述解冻液包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物+9～11mg/ml半乳糖+8～12mg/ml谷胱甘肽+4～7mol/ml海藻糖；所述稀释液1包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物+9～11mg/ml半乳糖+7～11mg/ml谷胱甘肽+3～6mol/ml海藻糖；所述稀释液2包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物+9～11mg/ml半乳糖+6～10mg/ml谷胱甘肽+2～4mol/ml海藻糖；所述清洗液包括：基础液+2～8mg/ml蛋白添加物。2.根据权利要求1所述的一种细胞玻璃化解冻液，其特征在于，所述基础液为改良的人输卵管液、M199或平衡盐溶液PBS。3.根据权利要求1所述的一种细胞玻璃化解冻液，其特征在于，所述蛋白添加物为人血清白蛋白或血清替代物。4.根据权利要求1所述的一种细胞玻璃化解冻液，其特征在于，所述解冻液、稀释液1、稀释液2和清洗液的pH值独立为7....

【专利技术属性】
技术研发人员：冯怀亮，
申请(专利权)人：瑞柏生物中国股份有限公司，
类型：发明
国别省市：