基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统技术方案

本发明专利技术公开了一种基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统，属于检测方法技术领域。该系统是利用RNA二代测序结果，可以对胶质母细胞瘤类器官的生物学特性进行评估。该评估系统有助于评估不同方法制作的胶质母细胞瘤类器官是否反映了亲代肿瘤的生物学特性，为不断优化胶质母细胞瘤类器官的制作方法提供生物学上的依据。作方法提供生物学上的依据。作方法提供生物学上的依据。

【技术实现步骤摘要】
基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统


[0001]本专利技术属于检测方法
，具体涉及一种基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统。

技术介绍

[0002]胶质母细胞瘤(GBM)是成人最常见的原发恶性脑肿瘤，预后较差。即使采用标准治疗，初诊的患者中位生存期仍16为至20个月。由于胶质母细胞瘤的异质性和侵袭性以及传统药物筛选方法的局限性，目前还没有开发出特别有效的抗肿瘤药物。药物筛选的经典模型是在二维平面培养肿瘤细胞系。然而，肿瘤细胞系在二维培养过程中，肿瘤内异质性较差，逐渐失去了亲代肿瘤的特征。这导致了抗肿瘤药物在前期研发过程中遇到很大的局限性。近年来，肿瘤类器官被广泛应用于药物的筛选和疗效评价，以探讨针对患者的个性化治疗策略。国外学者研究发现，患者来源的胶质母细胞瘤类器官可以保持亲代肿瘤的关键特征，包括组织学特征、细胞多样性、基因表达和突变谱。
[0003]虽然胶质母细胞瘤类器官维持了亲代肿瘤的一些生物学特性，但是目前尚未建立完整的评估体系。RNA二代测序可以检测基因在转录组水平的表达。相关研究虽然对胶质母细胞瘤类器官进行RNA二代测序，但并未深入挖掘其中的生物学信息，也没有充分利用测序的数据去评估胶质母细胞瘤类器官的生物学特性。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统。
[0005]本专利技术所采用的技术方案为：一种基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统，包括：
[0006]制备亲代胶质母细胞瘤组织样本和无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本；制备并处理有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本；
[0007]将所述无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本和有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本在RNA二代测序分析模块中进行评估，所述亲代胶质母细胞瘤组织样本作为对照；
[0008]所述分析模块包括差异基因分析模块、转录组突变分析模块、可变剪切分析模块、免疫浸润分析模块、趋势分析模块、以及在线网址进行分析和作图功能富集分析模块；
[0009]所述差异基因分析模块为分析样本间RNA差异表达的FDR阈值和差异倍数值；
[0010]所述转录组突变分析模块为分析转录本的突变体；采用ANNOVAR进行单核苷酸多态性的功能、基因组位点和突变位点的注释；
[0011]所述可变剪切分析模块为识别分析样本间的差异可变剪切；
[0012]所述免疫浸润分析模块为将表达矩阵上传至TIMER2.0数据库分析样本间的免疫细胞浸润情况；计算样本的肿瘤纯度；
[0013]所述趋势分析模块为将上述各样本经二代测序后得到的基因表达量矩阵，按时间顺序进行聚类，采用The short time
‑
series Expression Miner software软件进行处理；
[0014]所述在线网址进行分析和作图功能富集分析模块为分析所述趋势分析模块中的结果基因，采用假设检验计算、FDR阈值校正。
[0015]上述差异基因分析模块为采用edgeR软件进行分析；
[0016]上述转录组突变分析模块为采用GATK软件进行分析；采用ANNOVAR进行单核苷酸多态性的功能、基因组位点和突变位点的注释；
[0017]上述可变剪切分析模块为采用rMATS软件识别分析样本间的差异可变剪切；
[0018]上述免疫浸润分析模块为将表达矩阵上传至TIMER2.0数据库分析样本间的免疫细胞浸润情况；采用ESTIMATE软件计算样本的肿瘤纯度。
[0019]作为优选地，所述FDR阈值为低于0.05且差异倍数不低于2。
[0020]作为优选地，所述制备亲代胶质母细胞瘤组织样本的步骤包括：
[0021]将离体肿瘤组织样本在4℃无菌PBS缓冲液中冲洗后，在
‑
80℃保存。
[0022]作为优选地，所述制备无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本的步骤包括：
[0023]将离体肿瘤组织样本在4℃无菌PBS缓冲液中冲洗后，用无菌剪将肿瘤组织剪成1
‑
2mm直径的碎片，在
‑
80℃保存。
[0024]作为优选地，所述制备有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本的步骤包括：
[0025]将离体肿瘤组织样本在4℃无菌PBS缓冲液中冲洗并剪成1
‑
2mm直径的碎片后，置于培养基中进行培养，培养完成后用PBS缓冲液重悬后与水凝胶混匀、交联；
[0026]所述处理有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本的步骤包括：
[0027]将有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本，采用甲基丙烯酸化水凝胶裂解液将样本中的水凝胶裂解，1000
‑
1200rpm离心5
‑
6分钟，再用缓冲液将肿瘤组织碎片重悬，再次1000
‑
1200rpm离心5
‑
6分钟，弃上清，在
‑
80℃保存。
[0028]作为优选地，所述培养基配制为235ml DMEM:F12培养基+235ml神经基础培养基+5ml L
‑
谷氨酰胺添加剂+5ml青霉素/链霉素双抗+5ml N2添加剂+10ml B27添加剂+5ml非必须氨基酸溶液+125ul人胰岛素组成。
[0029]作为优选地，所述水凝胶由甲基丙烯酸化水凝胶和透明质酸混合而成；
[0030]所述甲基丙烯酸化水凝胶和透明质酸混合质量份数比为10:0.4
‑
0.5。
[0031]作为优选地，所述重悬后与水凝胶混匀的胶质母细胞瘤组织样本的体积比为1:1。
[0032]作为优选地，所述交联时采用400
‑
405nm的紫外光进行交联处理；
[0033]所述交联时长20
‑
30秒。
[0034]本专利技术的有益效果为：
[0035]本专利技术提供了一种基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统，该系统是利用RNA二代测序结果，可以对胶质母细胞瘤类器官的生物学特性进行评估。
[0036]该评估系统有助于评估不同方法制作的胶质母细胞瘤类器官是否反映了亲代肿瘤的生物学特性，为不断优化胶质母细胞瘤类器官的制作方法提供生物学上的依据。
附图说明
[0037]图1为治疗胶质母细胞瘤药物的靶基因在亲代肿瘤和类器官中的表达热图；
[0038]图2为胶质母细胞瘤类器官和亲代肿瘤中转录组突变和可变剪切分布示意图；
[0039]图3为免疫细胞浸润和肿瘤微环境分析；
[0040]图4为胶质母细胞瘤类器官培养过程中的基因变化趋势分析
‑
GO富集分析示意图；
[0041]图5为胶质母细胞瘤类器官培养过程中的基因变化趋势分析
‑
KEGG富集分析示意图。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统，其特征在于，包括：制备亲代胶质母细胞瘤组织样本和无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本；制备并处理有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本；将所述无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本和有水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本在RNA二代测序分析模块中进行评估，所述亲代胶质母细胞瘤组织样本作为对照；所述分析模块包括差异基因分析模块、转录组突变分析模块、可变剪切分析模块、免疫浸润分析模块、趋势分析模块、以及在线网址进行分析和作图功能富集分析模块；所述差异基因分析模块为分析样本间RNA差异表达的FDR阈值和差异倍数值；所述转录组突变分析模块为分析转录本的突变体；采用ANNOVAR进行单核苷酸多态性的功能、基因组位点和突变位点的注释；所述可变剪切分析模块为识别分析样本间的差异可变剪切；所述免疫浸润分析模块为将表达矩阵上传至TIMER2.0数据库分析样本间的免疫细胞浸润情况；计算样本的肿瘤纯度；所述趋势分析模块为将上述各样本经二代测序后得到的基因表达量矩阵，按时间顺序进行聚类，采用The short time
‑
series Expression Miner software软件进行处理；所述在线网址进行分析和作图功能富集分析模块为分析所述趋势分析模块中的结果基因，采用假设检验计算、FDR阈值校正。2.根据权利要求1所述的基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统，其特征在于，所述FDR阈值为低于0.05且差异倍数不低于2。3.根据权利要求1所述的基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统，其特征在于，制备所述亲代胶质母细胞瘤组织样本的步骤包括：将离体肿瘤组织样本在4℃无菌PBS缓冲液中冲洗后，在
‑
80℃保存。4.根据权利要求1所述的基于RNA二代测序的胶质母细胞瘤类器官生物学特性的评估系统，其特征在于，制备所述无水凝胶的胶质母细胞瘤类器官样本的步骤包括：将离体肿瘤组织样本在4℃无菌PBS缓冲液中冲洗后，用无菌剪将肿瘤组织剪成1
‑
2m...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁伦，牟永告，崔润，钟升，陈海燕，徐弢，王振宁，何振强，段昊，卢洁，余成伟，郭小瑜，胡宏荣，李畅，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心中山大学附属肿瘤医院，中山大学肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：