一种大规模均匀扩增细胞球方法技术

本发明专利技术提供了一种大规模均匀扩增细胞球方法，包括以下步骤：步骤1、将配制好的PDMS液体转移至预设有均匀阵列微孔的硅片上，待PDMS固化后将其与硅片分离，按阵列微孔孔径分割固化完成的PDMS获得微孔芯片；步骤2、将细胞悬液及其培养基引入微孔芯片的阵列微孔中，初步培养形成细胞球；步骤3、将细胞球转移至搅拌扩增装置，进行细胞球的动态扩增，搅拌扩增装置包括瓶体、瓶盖以及搅拌组件，搅拌组件包括依次连接的搅拌承托、搅拌轴、固定夹和搅拌子，瓶体内壁上涂有PDMS层。本发明专利技术能够实现细胞球的大规模均匀扩增，提高生物细胞及其分泌产物产量，可用于高通量、规模化药物检测分析，在细胞与细胞相互作用研究、组织工程和抗癌药物筛选方面具有巨大潜力。方面具有巨大潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种大规模均匀扩增细胞球方法


[0001]本专利技术涉及细胞扩增
，具体涉及一种大规模均匀扩增细胞球方法。

技术介绍

[0002]二维（2D）细胞扩增技术是目前细胞扩增最常用的方法之一，该方法操作简单且稳定，一个多世纪以来，2D细胞扩增被用作体外模型来研究细胞对来自生物物理和生物化学线索的刺激的反应。尽管2D细胞扩增技术已被人们广泛接受，并显著提高了我们对细胞行为的理解，但其扩增状态与生物细胞真实生存环境仍有着很大差别，存在较多的缺点与局限性，如会降低生物细胞的分化潜能、改变生物细胞的表型、改变生物细胞的免疫调节特性以及无法模拟正常细胞生长生理环境。因此，为顺应发展需求，三维（3D）细胞扩增技术受到研究推广。
[0003]不同于传统2D细胞扩增技术的平面培养，3D细胞扩增技术模拟了组织的真实异质性和微环境，并提供细胞
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细胞和细胞
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细胞外基质相互作用的信息，这为细胞
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细胞信号转导、药物开发和分子靶标的验证提供了一种新方法，迄今为止，人们已开发数种3D细胞扩增方法，例如悬滴法、旋转瓶培养法和微图案板法，但仍存在不足，如细胞生长空间狭窄、不易给药或向培养基中添加因子以及工艺复杂等，使目前的3D细胞扩增技术不易扩大规模，且所获细胞球的大小往往是不均匀的，以致其不适用于高通量药物测试，因此需要一种可放大进行细胞球的大规模扩增、所获细胞球更为均匀且工艺简单易于操作的扩增方法。

技术实现思路

[0004]为解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提出了一种大规模均匀扩增细胞球方法，包括以下步骤：步骤1、制备微孔芯片，将配制好的PDMS（聚二甲基硅氧烷）液体转移至预设有均匀阵列微孔的硅片上，所述阵列微孔的孔径至少有一种，固化PDMS，将固化完成PDMS与硅片分离，按阵列微孔孔径分割固化完成的PDMS获得微孔芯片；步骤2、将细胞悬液及其培养基引入微孔芯片的阵列微孔中，初步培养形成细胞球；步骤3、将初步培养的细胞球转移至搅拌扩增装置中，进行细胞球的动态扩增；所述搅拌扩增装置包括瓶体以及螺纹连接在瓶体上方瓶口处的瓶盖，所述瓶体内设有搅拌组件，搅拌组件包括搅拌承托、搅拌轴、固定夹和搅拌子，所述搅拌承托上方固定连接瓶盖内侧中心位置，搅拌轴上端转动连接在搅拌承托下方，搅拌轴下端固定连接有固定夹，搅拌子可拆卸连接在固定夹上，所述瓶体内壁上还涂有由PDMS液体固化形成的PDMS层。
[0005]优选的，所述步骤1具体为：1）按照PDMS基本组分：固化剂=10:1的质量比均匀混合PDMS基本组分和固化剂，制备PDMS液体；2）将混合好的PDMS液体置于真空干燥器中进行抽真空处理，通过真空处理使PDMS
液体中的气泡浮至液体表面，处理完毕后对PDMS液体进行消泡；3）将消泡完成的PDMS液体转移至预设有均匀阵列微孔的硅片上，待PDMS液体铺平；4）将铺平有PDMS液体的硅片在65
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150℃的温度范围内进行烘干，使PDMS液体固化完全；5）将固化完全的PDMS从硅片上分离，并按阵列微孔孔径大小进行分类切割，即得到微孔芯片；所述步骤2具体为：1）用PBS缓冲液冲洗单层细胞，并利用一定浓度的细胞消化液对单层细胞进行分离，将分离后的细胞悬浮在培养基中分散计数，随后在培养基中制备一定浓度的细胞悬液，用吸管或移液器将细胞悬液及其培养基一并引入阵列微孔中，细胞悬液及其培养基在重力作用下沉降到阵列微孔底部，将接种有细胞悬液及其培养基的微孔芯片放入培养箱中进行培养，初步形成细胞球；所述步骤3具体为：1）将初步培养的细胞球转移至瓶体内，组装搅拌扩增装置，利用搅拌扩增装置的搅拌组件对瓶体内的细胞球进行搅拌扩增。
[0006]搅拌扩增装置通过磁力搅拌器提供动力进行搅拌，在磁场作用下，搅拌子受磁力搅拌器控制产生转动，而固定夹使搅拌子处于在瓶体内中下端进行转动，带动瓶体内的细胞球进行充分混合。
[0007]优选的，所述硅片上的阵列微孔按孔径大小分类排布，相同孔径的阵列微孔位于同一阵列区域。
[0008]优选的，所述硅片上的阵列孔按直径可分为四类，四类阵列孔直径分别为0.2mm、0.3mm、0.4mm以及0.5mm。
[0009]优选的，所述搅拌承托内部设有直径不同的两个圆形孔洞且两孔洞连通，第一孔洞位于搅拌承托上部，第二孔洞位于搅拌承托下部，第一孔洞与第二孔洞相接处形成承托平面，所述第二孔洞直径大于搅拌轴直径，搅拌轴上端设置有与其垂直的金属杆，所述金属杆长度不大于第一孔洞直径并大于第二孔洞直径，搅拌轴上端通过金属杆卡设在承托平面处。
[0010]优选的，所述搅拌轴靠近上端面的轴体上贯穿设有安装孔，安装孔直径不小于金属杆直径，金属杆可穿入安装孔与搅拌轴可拆卸连接。
[0011]优选的，所述固定夹为空腔结构，固定夹安装端开口，所述搅拌子通过开口嵌入固定夹容腔中实现安装。
[0012]优选的，所述搅拌承托上方通过聚丙烯（PP）胶粘接固定到瓶盖内侧，在60
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120℃的温度范围内烘干固化聚丙烯胶。
[0013]优选的，所述搅拌扩增装置中的搅搅拌承托、搅拌轴和固定夹由3D打印技术制备；所述瓶体材料选用低硼硅医药专用玻璃，所述瓶盖材料选用聚丙烯（PP），所述搅拌承托、搅拌轴和固定夹的材料选用尼龙12（PA12），所述金属杆的材料选用不锈钢。
[0014]本专利技术具有以下有益效果：1、 本专利技术利用微孔芯片进行均匀培养细胞球，微孔芯片的孔数多，可以一次性制备数量众多的细胞球，且每个微孔芯片上的孔大小均匀一致，使初步培养出的细胞球形态也均匀一致，同时利用搅拌扩增装置对初步培养的细胞球进行动态扩增，搅拌扩增装置的
搅拌承托、搅拌轴和固定夹由3D打印技术制备，基于3D打印技术制作时装置尺寸易于放大，细胞生长空间大，可一次性进行大体积的细胞球扩增，本专利技术综合利用了微孔芯片和搅拌扩增装置，能够实现细胞球的大规模均匀扩增，扩增过程工艺简单且易于操作。
[0015]2、 本专利技术的微孔芯片制作简单，无需复杂的化学技术，且微孔芯片的成分为聚二甲基硅氧烷，生物相容性好，适于细胞的培育。
[0016]3、 本专利技术的搅拌扩增装置的搅拌承托、搅拌轴和固定夹由3D打印技术制备，制作工艺简单，成本低且易于组装，搅拌扩增装置的瓶体内壁上涂有PDMS液体，PDMS液体固化形成透明PDMS层，可防止细胞球沉底和贴瓶壁生长，同时搅拌扩增装置通过磁力搅拌器控制转速，细胞球的大小及形态与搅拌转速、剪切力有关，可通过控制搅拌扩增器转速来限制细胞球的大小，保持其形态均匀，另外搅拌扩增装置部分组件所用的材料PA12具有无生物毒性、耐高温高压不变形，以及低吸湿性的特性，可进行高压蒸汽灭菌，防止影响细胞球扩增体系。
[0017]4、 本专利技术有效模拟了生物细胞体内生长的真实环境，为细胞创造了适宜的扩增环境，既避免了细胞贴壁现象所导致的细胞球扩增限制，实现了细胞球的大规模扩增，又通过对微孔大小形状、搅拌速度的控制使培育出的细胞球大小形态均匀，可应用于高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种大规模均匀扩增细胞球方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、制备微孔芯片，将配制好的PDMS液体转移至预设有均匀阵列微孔的硅片上，所述阵列微孔的孔径至少有一种，固化PDMS，将固化完成PDMS与硅片分离，按阵列微孔孔径分割固化完成的PDMS获得微孔芯片；步骤2、将细胞悬液及其培养基引入微孔芯片的阵列微孔中，初步培养形成细胞球；步骤3、将初步培养的细胞球转移至搅拌扩增装置中，进行细胞球的动态扩增；所述搅拌扩增装置包括瓶体（1）以及螺纹连接在瓶体（1）上方瓶口处的瓶盖（2），所述瓶体（1）内设有搅拌组件，搅拌组件包括搅拌承托（3）、搅拌轴（4）、固定夹（5）和搅拌子（7），所述搅拌承托（3）上方固定连接瓶盖（2）内侧中心位置，搅拌轴（4）上端转动连接在搅拌承托（5）下方，搅拌轴（4）下端固定连接有固定夹（5），搅拌子（7）可拆卸连接在固定夹（5）上，所述瓶体（1）内壁上还涂有由PDMS液体固化形成的PDMS层。2.根据权利要求1所述的一种大规模均匀扩增细胞球方法，其特征在于：所述步骤1具体为：1）按照PDMS基本组分：固化剂=10:1的质量比均匀混合PDMS基本组分和固化剂，制备PDMS液体；2）将混合好的PDMS液体置于真空干燥器中进行抽真空处理，通过真空处理使PDMS液体中的气泡浮至液体表面，处理完毕后对PDMS液体进行消泡；3）将消泡完成的PDMS液体转移至预设有均匀阵列微孔的硅片上，待PDMS液体铺平；4）将铺平有PDMS液体的硅片在65
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150℃的温度范围内进行烘干，使PDMS液体固化完全；5）将固化完全的PDMS从硅片上分离，并按阵列微孔孔径大小进行分类切割，即得到微孔芯片；所述步骤2具体为：1）用PBS缓冲液冲洗单层细胞，并利用一定浓度的细胞消化液对单层细胞进行分离，将分离后的细胞悬浮在培养基中分散计数，随后在培养基中制备一定浓度的细胞悬液，用吸管或移液器将细胞悬液及其培养基一并引入阵列微孔中，细胞悬液及其培养基在重力作用下沉降到阵列微孔底部，将接种有细胞悬液及其培养基的微孔芯片放入培养箱中进行培养，初步形成细胞球；所述步骤3具体为：1）将初步培养的细胞球转移至瓶...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄晓文，刘海霞，张太毅，陈嘉词，杨崇辉，宋佳澳，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：