一种支链DNA的合成方法技术

本发明专利技术公开了一种支链DNA的合成方法。本发明专利技术突破了分支DNA合成的关键技术，解决了现有合成工艺只能合成直链不能合成分支的问题，在应用上可以提高DNA探针的荧光强度8～10倍，从而克服了传统的realtimePCR技术中的缺陷与不确定因素，无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，只要将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大后即可迅速得到基因定量结果。另外，由于分支结构DNA打破了传统直链DNA概念，而且本发明专利技术合成工序和成本更低，效率更高，为分子生物学开辟了新的技术路线，提供更多的技术方案。更多的技术方案。更多的技术方案。

【技术实现步骤摘要】
一种支链DNA的合成方法


[0001]本专利技术涉及合成DNA、RNA、蛋白质及类似分子的改进的方法，特别涉及一种支链DNA的合成方法。

技术介绍

[0002]支链DNA(Branched DNA，缩写成bDNA)指一种人工合成的、由于在结构上整合了带有被保护羟基的核苷衍生物而形成的分支状的寡脱氧核糖核酸。
[0003]目前人工合成的DNA绝大多数都是直链型的寡脱氧核糖核酸，这种寡脱氧核糖核酸类似于一根直直的链条。而bDNA是一种离散的、高度分枝的、单分散的寡脱氧核糖核酸，带分支树枝状序列结构的DNA具有让人联想到树分枝的图案。基于bDNA具有树枝状大分子的特点，其具有以下几点优点：一、由于支链结构的形成了5'末端的数量成比例地增加，因此可以5'末端或者树枝状序列的中间成比例地增加修饰化学基团，比如在这些支链序列上修饰荧光信号，相比于普通的直链型的寡脱氧核糖核酸，支链DNA所产生的荧光信号可以成倍数地增加。二、树枝状分支结构的支链DNA对Taq聚合酶的外切活性具有降解抗性，可防止酶对支链的影响，经PCR反应后，可以由形成多个多重标记的单链探针。三、分支结构可以增加DNA的解链温度，因此可以提高PCR反应的ΔTm(完全匹配的Tm值与错配的Tm值之差)，从而减少错配。
[0004]因此bDNA技术具有高灵敏度、检测范围大和准确定量等优点，对各种普通样本和qPCR很难分析的血液样本与保存多年后mRNA高度降解的甲醛固定石蜡包埋的FFPE样本同样具有极高的准确度与重现性。最常见的DNA诊断方法是扩增目标序列，以产生足够的拷贝，以便使用常规检测系统观察到信号。而bDNA相比于普通直链型DNA可以通过分支状结构进行信号放大，甚至无需PCR扩增即可直接分析出目标DNA。
[0005]bDNA技术不仅用于病毒DNA或RNA的检测，也可用于检测细胞内基因的表达水平，在临床检测和科研工作中应用越来越广泛。采用该技术“人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7 mRNA检测试剂盒(支链DNA信号扩增法)”也已经于2010年在国内实现商业化上市推广，其技术就是依托于bDNA，信号放大技术，其不依赖于指数级的核酸分子扩增，在业内首次实现了HPV检测的高特异性，高信号灵敏度，处于全球领先。
[0006]然而bDNA的合成技术一直是西门子公司旗下Chiron公司独有的垄断性专利技术，该技术的合成原料和合成工艺都处高度保密的状态，其对外商业化合成的bDNA产品在国内外虽然有销售，但是交付周期长，而且售价也极其昂贵，致使该技术应用于诊断试剂盒等产品中时，终产品成本高居不下，售价极其昂贵，非常不利于大规模应用，从而制约了bDNA技术的国产化和推广应用。
[0007]目前在国外独家专利保护的情况下，急需一种全新的更加高效低成本的bDNA合成方法来解决上述问题。本专利技术就能够很好地解决该问题，打破国外技术垄断，市场售价仅为西门子公司的1/5，极大地加快bDNA技术的国产化和推广应用。

技术实现思路

[0008]本专利技术要解决的技术问题是提供一种了合成工序和成本更低，效率更高，为分子生物学开辟了新的技术路线的支链DNA的合成方法。
[0009]为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案为：
[0010]一种支链DNA的合成方法，包括DNA合成单体，所述DNA合成单体的氨基基团由乙酰丙氨基进行保护，所述乙酰丙通过还原剂硼氢化钠将基还原。
[0011]进一步，所述DNA合成单体为核苷亚磷酰胺，所述核苷亚磷酰胺3
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位的磷酸根由二异丙氨基和腈乙基修饰，5
’
位的羟基由二甲氧基三苯甲基修饰，所述A、C、G三种核苷酸的杂环各存在一个氨基基团，且分别被苯甲酰基和异丙酰基保护形成LEV
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dA、LEV
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dC、LEV
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dG三种核苷酸单体，所述5
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位的二甲氧基三苯甲基由三氯乙酸进行脱除。
[0012]进一步，所述A、C、G核苷酸位点进行分支结构合成时，可将经乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到该位点上，合成上的LEV
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dA(或LEV
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dC，或LEV
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dG)不影响整个DNA主链后继缩合循环反应，待主链合成结束后，利用强还原剂硼氢化钠对乙酰丙酰基(LEV)进行还原，从而形成一个裸露的羟基(
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OH)，可以参与DNA合成的聚合反应，形成一个带枝丫的DNA结构，可在此枝丫的羟基上进行常规核苷酸的缩合。
[0013]进一步，所述乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到DNA的主链上之后，被还原形成裸漏羟基的DNA枝丫结构，然后通过亚磷酰胺三酯法将普通的核苷酸单体合成到上述提到LEV
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核苷酸的羟基上，然后得到更长的DNA支链。
[0014]进一步，所述羟基由活化脂(NHS ESTER)原料活化于荧光基团上，使其与
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NH2基团之间化学反应，且将荧光标记的功能基团连接到一段带有
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NH2活性基团的寡核苷酸序列上的原理。
[0015]本专利技术的有益效果：
[0016]本专利技术突破了分支DNA合成的关键技术，解决了现有合成工艺只能合成直链不能合成分支的问题，在应用上可以提高DNA探针的荧光强度8～10倍，从而克服了传统的real time PCR技术中的缺陷与不确定因素，无需抽提纯化RNA，无需反转录，无需PCR扩增，只要将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大后即可迅速得到基因定量结果。另外，由于分支结构DNA打破了传统直链DNA概念，而且本专利技术合成工序和成本更低，效率更高，为分子生物学开辟了新的技术路线，提供更多的技术方案。
附图说明
[0017]图1为本专利技术中光谱分析的示意图。
具体实施方式
[0018]下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本专利技术，但并不构成对本专利技术的限定。此外，下面所描述的本专利技术各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0019]一种支链DNA的合成方法，包括DNA合成单体，所述DNA合成单体的氨基基团由乙酰丙氨基进行保护，所述乙酰丙通过还原剂硼氢化钠将基还原。
[0020]所述DNA合成单体为核苷亚磷酰胺，所述核苷亚磷酰胺3
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位的磷酸根由二异丙氨
基和腈乙基修饰，5
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位的羟基由二甲氧基三苯甲基修饰，所述A、C、G三种核苷酸的杂环各存在一个氨基基团，且分别被苯甲酰基和异丙酰基保护形成LEV
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dA、LEV
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dC、LEV
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dG三种核苷酸单体，所述5
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位的二甲氧基三苯甲基由三氯乙酸进行脱除，
[0021]所述A、C、G核苷酸位点进行分支结构合成时，可将经乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种支链DNA的合成方法，其特征在于，包括DNA合成单体，所述DNA合成单体的氨基基团由乙酰丙氨基进行保护，所述乙酰丙通过还原剂硼氢化钠将基还原。2.根据权利要求1所述的一种支链DNA的合成方法，其特征在于，所述DNA合成单体为核苷亚磷酰胺，所述核苷亚磷酰胺3
’
位的磷酸根由二异丙氨基和腈乙基修饰，5
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位的羟基由二甲氧基三苯甲基修饰，所述A、C、G三种核苷酸的杂环各存在一个氨基基团，且分别被苯甲酰基和异丙酰基保护形成LEV
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dA、LEV
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dC、LEV
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dG三种核苷酸单体，所述5
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位的二甲氧基三苯甲基由三氯乙酸进行脱除。3.根据权利要求1所述的一种支链DNA的合成方法，其特征在于，所述A、C、G核苷酸位点进行分支结构合成时，可将经乙酰丙酰基(LEV)保护的核苷酸单体合成到该位点上，合成上的LEV
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dA(或LEV
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【专利技术属性】
技术研发人员：蒙文宝，
申请(专利权)人：南宁捷尼斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：