一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法及其应用，包括如下步骤：S1.用商品化的生物素标记新冠病毒RBD单克隆抗体，制备出生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体；S2.将生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体结合到商品化链霉素亲和磁珠上得到抗体

【技术实现步骤摘要】
一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，尤其涉及一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，由于新冠疫情的流行，新冠病毒已成为全球研究热点。用新冠患者或新冠病毒感染动物模型的组织材料进行核酸定量、免疫印迹、单细胞测序等实验可以帮助我们更深入地研究新冠病毒的致病机制。新冠病毒的受体人ACE2在不同组织的表达丰度存在差异，一些ACE2表达量低的组织，被病毒感染的阳性细胞的数量也低，使得感染的判定较为困难。另一方面，由于常见病料如拭子、痰液、肺泡灌洗液中的细胞成分较少，且病毒阳性细胞极少，使得用于单细胞测序的样本有很高的背景。
[0003]传统的流式细胞分选技术可以分离得到感染组织中新冠病毒感染的阳性细胞，但这一方法制样过程复杂，需要的上样细胞量较大，且必须在生物安全高等级实验室（BSL3级实验室）中完成整个分选流程，因此有必要建立一种快速富集被新冠病毒感染的阳性细胞的方法，为单细胞测序等实验提供纯度高且浓度也高的初始样品。
[0004]因此，针对上述技术问题，本专利技术设计了一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法及其应用。

技术实现思路

[0005]针对上述不足，本专利技术的目的是提供一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法及其应用。
[0006]本专利技术提供了如下的技术方案：一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法，包括如下步骤：S1.用商品化的生物素标记新冠病毒RBD单克隆抗体，制备出生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体；S2.将生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体结合到商品化链霉素亲和磁珠上得到抗体
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磁珠复合物；S3.将制备好的抗体
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磁珠复合物与细胞或充分解离的组织孵育30 分钟，用磁性分离器进行磁性分离，多次洗涤去除未能结合的细胞，降低背景；S4. 获得纯度较高、活性较好的新冠病毒感染阳性细胞可用于后续实验。
[0007]进一步的，步骤S1的具体操作流程：S11.按照生物素与抗体蛋白物质的量比为3:1，计算需要的生物素及抗体的量；S12.取出新冠病毒RBD单克隆抗体，用PBS溶解到相应浓度后放冰上待用；S13.根据说明书用DMSO或DMF将生物素溶解到10 mM，分装并保存于
‑
20℃备用。使用前，取出生物素恢复至室温；S14.将生物素加至新冠病毒RBD单克隆抗体中，室温孵育30分钟或冰上孵育2小
时；S15. 将S14步骤中的生物素
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新冠病毒RBD单克隆抗体的孵育液加至50KDa超滤管中，加入5
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10倍孵育液体积的PBS，4℃、3000g离心，过滤除去过量的未结合抗体的生物素；S16.将超滤管中生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体浓缩至合适体积，吸至新离心管中，加入等体积的甘油，得到生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体，分装并保存于
‑
20℃备用。
[0008]进一步的，步骤S2的具体操作流程：S21.将磁珠瓶置于漩涡振荡器上20 s，震荡重悬磁珠，用移液器吸取100 uL磁珠到新离心管中，将离心管放置于磁性分离器，静置1分钟（此操作后续简称为磁性分离），用移液器移除上清液，从磁性分离器上取下离心管；S22.加入1mL Buffer II到离心管中，盖上离心管盖，上下颠倒充分重悬磁珠，磁性分离，移除上清液；S23.重复步骤S22，共洗涤3次；S24.将25ug生物素化的新冠病毒RBD抗体用Buffer II稀释到1 mL，并用稀释后的RBD抗体液重悬磁珠，使磁珠的浓度为1mg/mL；S25.上下颠倒充分重悬磁珠，将离心管置于旋转混匀仪上，室温旋转混匀60分钟，磁性分离，移除上清液；S26.按照步骤S22，洗涤5次；S27.加入100 uL的Buffer II或PBS的缓冲液重悬磁珠，即得到抗体
‑
磁珠复合物，保存于4℃备用。
[0009]进一步的，步骤S3的具体步骤包括：S311.用无菌PBS将新冠病毒感染24小时的Caco2细胞洗涤一次，加入胰酶进行消化，后用DMEM+10%FBS终止消化， 300g离心10分钟，移除上清液，收集细胞；S312.轻弹离心管壁将磁珠混匀，用200 uL的抗体
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磁珠复合物将Caco2细胞重悬，轻柔混匀，后放置于4℃孵育30分钟；S313.用磁性分离器富集结合细胞和未结合细胞的磁珠，移除上清液，用500 uL的PBS
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Tween溶液对磁珠进行重悬混匀，再次进行磁性分离，移除上清液；S314.加入4%的多聚甲醛将结合细胞和未结合细胞的磁珠重悬，轻柔混匀，放置于4℃固定过夜；S315.进行磁性分离，移除4%的多聚甲醛，用500 uL的PBS
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Tween溶液进行重悬，充分混匀，再次进行磁性分离，移除上清液，此步骤重复2次；S316.稀释兔抗新冠病毒N蛋白抗体，将抗体按1:500的比例加入PBS
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Tween
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T中，充分混匀，得到一抗溶液；S317.用200 uL的一抗溶液重悬结合细胞和未结合细胞的磁珠，轻柔混匀，放置于4℃孵育30分钟；S318.磁性分离，移除上清液，用500 uL的PBS
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Tween溶液进行重悬，充分混匀，再次进行磁性分离，移除上清液；S319.将CY3 conjugated
ꢀ‑
anti
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Rabbit IgG抗体及FITC conjugated
ꢀ‑
anti
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Mouse IgG抗体按1:100的比例加入PBS
‑
Tween
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T中，充分混匀，得到二抗溶液；
S320.用200 uL二抗溶液重悬结合细胞和未结合细胞的磁珠，轻柔混匀，于室温避光孵育30分钟；S321.磁性分离，移除上清液，用500 uL的PBS
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Tween溶液重悬，充分混匀，再次进行磁性分离，移除上清液，该步骤重复2次；S322.用200 uL的PBS
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Tween重悬结合细胞和未结合细胞的磁珠，用流式滤网过滤，后用流式细胞仪进行检测。
[0010]一种基于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法的结合效率的检测方法。
[0011]其中，结合效率的检测方法，包括如下步骤：F1.稀释兔抗新冠病毒N蛋白抗体，将抗体按1:500的比例加入PBS
‑
Tween
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T中，充分混匀，得到一抗溶液；F2.用磁性分离器磁性分离结合细胞和未结合细胞的磁珠，移除上清液，用200 uL的一抗溶液重悬，轻柔混匀，放置于4℃孵育30分钟；F3.用磁性分离器富集结合细胞和未结合细胞的磁珠，移除上清液，用500 uL的PBS
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Tween溶液对磁珠进行重悬混匀，再次磁性分离，移除上清液；F4. 将CY3 conjugated
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.用商品化的生物素标记新冠病毒RBD单克隆抗体，制备出生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体；S2.将生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体结合到商品化链霉素亲和磁珠上得到抗体
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磁珠复合物；S3.将制备好的抗体
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磁珠复合物与细胞或充分解离的组织孵育30 分钟，用磁性分离器进行磁性分离，多次洗涤去除未能结合的细胞，降低背景；S4. 获得的富集新冠病毒感染细胞可用于后续实验。2.根据权利要求1所述的一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法，其特征在于，步骤S1的具体操作流程：S11.按照生物素与抗体蛋白物质的量比为3:1，计算需要的生物素及抗体的量；S12.取出新冠病毒RBD单克隆抗体，用PBS溶解到相应浓度后放冰上待用；S13.根据说明书用DMSO或DMF将生物素溶解到10 mM，分装并保存于
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20℃备用；其中，使用前，取出生物素恢复至室温；S14.将生物素加至新冠病毒RBD单克隆抗体中，室温孵育30分钟；S15.将S14步骤中的生物素
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新冠病毒RBD单克隆抗体的孵育液加至50KDa超滤管中，加入5
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10倍孵育液体积的PBS，4℃、3000g离心，过滤除去过量的未结合抗体的生物素；S16.将超滤管中生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体浓缩至合适体积，吸至新离心管中，加入等体积的甘油，得到生物素化的新冠病毒RBD单克隆抗体，分装并保存于
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20℃备用。3.根据权利要求1所述的一种用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法，其特征在于，步骤S2的具体操作流程：S21.将磁珠瓶置于漩涡振荡器上20 s，震荡重悬磁珠，用移液器吸取100 uL磁珠到新离心管中，将离心管放置于磁性分离器，静置1分钟，用移液器移除上清液，从磁性分离器上取下离心管；S22.加入1mL Buffer II到离心管中，盖上离心管盖，上下颠倒充分重悬磁珠，磁性分离，移除上清液；S23.重复步骤S22，共洗涤3次；S24.将25ug生物素化的新冠病毒RBD抗体用Buffer II稀释到1 mL，并用稀释后的RBD抗体液重悬磁珠，使磁珠的浓度为1mg/mL；S25.上下颠倒充分重悬磁珠，将离心管置于旋转混匀仪上，室温旋转混匀60分钟，磁性分离，移除上清液；S26.按照步骤S22，共洗涤5次；S27.加入100 uL的Buffer II或PBS的缓冲液重悬磁珠，即得到抗体
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磁珠复合物，保存于4℃备用。4.根据权利要求2所述的用于快速富集新冠病毒感染阳性细胞的方法，其特征在于，步骤S3的具体步骤包括：S311.用无菌PBS将新冠病毒感染24小时的Caco2细胞洗涤一次，加入胰酶进行消化，后用DMEM+10%FBS终止消化，300g离心10分钟，移除上清液，收集细胞；
S312.轻弹离心管壁将磁珠混匀，用200 uL的抗体
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磁珠复合物将Caco2细胞重悬，轻柔混匀，后放置于4℃孵育30分钟；S313.用磁性分离器富集结合细胞和未结合细胞的磁珠，移除上清液，用500 uL的PBS
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Tween溶液对磁珠进行重悬混匀，再次磁性分离，移除上清液；S314.加入4%的多聚甲醛将结合细胞和未结合细胞的磁珠重悬，轻柔混匀，放置于4℃...

【专利技术属性】
技术研发人员：周鹏，张玮，沈旭蕊，石正丽，严兵，
申请(专利权)人：南京科冠生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：