猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条，设有载体板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜、猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线、对照线和吸水垫。本发明专利技术的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条，具有检测快速、简便、准确、灵敏等特点，并具有较高的稳定性；受外界因素影响较小，检测灵敏度和准确性高；能稳定保存，携带方便，不需仪器设备，综合成本较低，非常适合临床和基层单位使用。本发明专利技术的试纸操作简单易掌控，无需专业人员操作。无需专业人员操作。无需专业人员操作。

【技术实现步骤摘要】
猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的免疫层析试剂条及其制备方法


[0001]本专利技术属于体外免疫诊断
，涉及一种用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条及其制备方法。

技术介绍

[0002]冠状病毒(Coronaviruses，CoV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒亚科(Coronavirinae)，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，拥有已知RNA病毒中最大的基因组序列长度。
[0003]目前，猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndromecoronavirus,SADS
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CoV)在社会上广受关注，针对病毒类抗原的检测，一直是病毒类疾病检测的主要方法之一。目前，对于猪SADS
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CoV的检测以核酸法占绝对地位，尚没有SADS
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CoV抗原检测试剂。因此，获得能够快读检测该病毒抗体的试剂盒或试纸条成为本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS
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CoV)抗原的胶体金免疫层析试剂条。本专利技术采用自行制备的SADS
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CoV重组抗原S1蛋白免疫小鼠，筛选单克隆抗体，然后利用筛选的单克隆抗体，制备了双抗体夹心法检测SADS
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CoV
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S1抗原的胶体金免疫层析试剂。
[0005]本专利技术通过以下技术方案实现本专利技术的目的：
[0006]一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条，设有载体板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜、猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线、质控线和吸水垫；
[0007]样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次粘贴在载体板上表面，样品垫的一端设在胶体金结合垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸水垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线和质控线依次设在硝酸纤维膜上；胶体金结合垫上喷有猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体与胶体金结合的复合物；在所述检测线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的抗体，在质控线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的重组抗原。
[0008]优选地，所述载体板可采用PVC板。
[0009]本专利技术还提供了一种制备本专利技术试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0010]S1制备猪急性腹泻综合征冠状病毒重组抗原：采用基因克隆技术，PCR扩增编码猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原(SADS
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CoV的S1糖蛋白亚单位抗原) 的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，再经蛋白纯化技术，获得猪急性腹泻综合征冠状病毒重组抗原，记为：SADS
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CoV
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S1。
[0011]S2制备胶体金溶液：取1.0ml的1％氯金酸溶液加入到100mL去离子双蒸水中，得到浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液 2mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中2～8℃保存备用；
[0012]S3制备胶体金结合垫：将胶体金与SADS
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CoV
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S1单克隆抗体复合物溶液喷至结合垫上，喷量为2～4μl/cm；将喷好的结合垫置于干燥室干燥，备用；
[0013]S4在硝酸纤维膜上制备质控线C和检测线T：将步骤S1制备的抗原溶液稀释至1.0～2.0mg/ml的质控线溶液；将SADS
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CoV
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S1单克隆抗体溶液稀释成 0.5～1.0mg/ml的检测线溶液；通过喷金划膜仪将所述质控线溶液与所述检测线溶液分别喷至硝酸纤维膜上质控线与检测线的位置，二者之间间隔5～8mm，包被量均为1.0～2.0μl/cm；将划好的膜置于干燥室干燥后，备用；
[0014]S5样品垫的预处理：将样品垫用预处理液浸泡30min，沥干后置于干燥室干燥12h后，备用；
[0015]S6制备免疫层析检测条：将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次粘贴在载体板上表面，将样品垫的一端设在胶体金结合垫的一端上；胶体金结合垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上；吸水垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上；用切条机切成条状，得到用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条。
[0016]优选地，所述步骤S3中胶体金与SADS
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CoV
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S1单克隆抗体复合物溶液的制备方法如下：在1ml胶体金溶液中加入2～10μl的0.1mol/L K2CO3溶液混匀，加入5～10μg SADS
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CoV
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S1单克隆抗体混匀之后，再加入50～100μl的10％ BSA溶液进行封闭，置于冷冻离心机内离心，弃上清液，取沉淀用胶体金溶液复溶，获得SADS
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CoV抗体
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胶体金复合物溶液。
[0017]优选地，上述使用的胶体金溶液还包含pH8.2的0.02mol/l Tris缓冲液， 0.1％Casein，0.3％～0.5％聚乙烯吡咯烷酮(PVP40)，2～5％海藻糖。
[0018]优选地，所述步骤S4稀释液为pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液。
[0019]优选地，所述步骤S5样品垫预处理液为：pH7～8，含有质量浓度为0.2
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1％的吐温
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20和0.1
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0.5％的海藻糖的Tris
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Hcl缓冲液。
[0020]本专利技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条的检测原理为：
[0021]将本专利技术的试剂条的样品垫一端插入到样品中，根据双抗夹心免疫层析原理，由胶体金结合标记的猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体(即金标抗体)与检测样品中的抗原反应，形成金标抗体
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病毒抗原复合物，当该复合物层析至硝酸纤维膜上预先包被在检测线上的特异性猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体(即特异抗体)处时，此处的抗体会识别该复合物中的抗原与其结合，其结果便形成了金标抗体
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病毒抗原
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特异抗体的夹心结构，最终金标抗体上的胶体金颗粒在此处固定并累积，出现肉眼可见的红色线，而未反应的金标抗体仍继续层析前行，当达到预先包被在质控线上的猪急性腹泻综合征冠状病毒的重组抗原时，发生抗体抗原结合反应，未与样品中病毒抗原结合的金标抗体被重组抗原捕捉，形成金标抗体
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病毒重组抗原复合物，从而在质控线也出现由胶体金颗粒固定并累积显现出肉眼可见的红色线。
[0022]根据上述检测原理，最终检测结果是：1、检测线、质控线均显示红色，表示检测结果为阳性，说明样品中含有猪急性腹泻综合征冠状病毒；2、检测线不显色，质控线显示红
色，表示检测结果为阴性，说明样品中不含本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原的胶体金免疫层析试剂条，其特征在于，所述试纸条上设有载体板、样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜、猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线、质控线和吸水垫；样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫依次粘贴在载体板上表面，样品垫的一端设在胶体金结合垫的一端上，胶体金垫的另一端设在硝酸纤维膜的一端上，吸水垫的一端设在硝酸纤维膜的另一端上，猪急性腹泻综合征冠状病毒抗原检测线和质控线依次设在硝酸纤维膜上；胶体金结合垫上喷有猪急性腹泻综合征冠状病毒抗体与胶体金结合的复合物；在所述检测线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的抗体，在质控线处包被猪急性腹泻综合征冠状病毒的重组抗原。2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述载体板可采用PVC板。3.一种制备如权利要求1所述的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1制备猪急性腹泻综合征冠状病毒重组抗原：采用基因克隆技术，PCR扩增编码猪急性腹泻综合征冠状病毒S1糖蛋白亚单位的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，再经蛋白纯化技术，获得猪急性腹泻综合征冠状病毒重组抗原，记为：SADS
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CoV
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S1。S2制备胶体金溶液：取1.0ml的1％氯金酸溶液加入到100mL去离子双蒸水中，得到浓度为0.01％的氯金酸溶液，加热至沸腾，加入1％柠檬酸三钠溶液2mL，继续加热直至溶液呈葡萄酒色为止，冷却后置于棕色瓶中2～8℃保存备用；S3制备胶体金结合垫：将胶体金与SADS
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CoV
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S1单克隆抗体复合物溶液喷至结合垫上，喷量为2～4μl/cm；将喷好的结合垫置于干燥室干燥，备用；S4在硝酸纤维膜上制备质控线C和检测线T：将步骤S1制备的抗原溶液稀释至1.0～2.0mg/ml的质控线溶液；将SADS
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CoV
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S1单克隆抗体溶液稀释成0.5～1.0mg/ml的检测线溶液；通过喷金划膜仪将所述质控线溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：昝洁，陈翠翠，梁焕坤，赖宏锐，郭桂铃，李来庆，宁波，
申请(专利权)人：昝洁，
类型：发明
国别省市：