基于多孔Au@Pd纳米核壳结构的三明治型AFB1电化学检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于多孔Au@Pd纳米核壳结构的三明治型AFB1电化学检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括GCE、HAuCl4、柠檬酸三钠、MWCNTs、CMK

【技术实现步骤摘要】
基于多孔Au@Pd纳米核壳结构的三明治型AFB1电化学检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及一种基于多孔Au@Pd纳米核壳结构的“适配体
‑
抗体”三明治型AFB1电化学检测试剂盒及检测方法，属于生物分析


技术介绍

[0002]黄曲霉毒素B1(AFB1)是一种常见的分布广泛的霉菌毒素，有强烈的生物毒性。人体持续摄入微量AFB1可引发慢性中毒，生长障碍，纤维性病变等症状。此外，AFB1还具有极强的致癌、致畸和致突变作用。考虑到AFB1的风险和威胁，对食品、药材中AFB1的高灵敏检测，在医学、病理学、临床分析、食品检测等领域具有重要意义。
[0003]目前常用的AFB1检测方法有很多，如薄层色谱法、液相色谱法、酶联免疫法等。但这些方法大多存在实验过程复杂，消耗时间长，设备昂贵等缺点。因此，开发出一种选择性好、稳定性高、操作简单且检测灵敏度高的AFB1检测方法十分必要。
[0004]近年来，适配体因具有成本低、化学性质稳定、易修饰、制备简单以及可有效识别离子靶标等优点被广泛用于各种生物分子检测。基于电化学的适配体传感器用于检测待测物时，适配体可与待测物特异性结合，并导致其自身空间结构发生改变，从而引起电流等电信号的改变，最终建立电信号与待测物之间的关系。但传统的电极表面积较小，对待测物质的结合能力有限，因此本专利技术旨在构建一种新的具有灵敏度高、选择性好、稳定性高等优点的AFB1检测试剂盒，以实现食品、中药材中AFB1的快速实时检测。

技术实现思路

[0005]针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种基于多孔Au@Pd纳米核壳结构的“适配体
‑
抗体”三明治型AFB1电化学检测试剂盒及检测方法，该方法具有灵敏度高、选择性好、稳定性高等优点。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案之一是：
[0007]一种基于多孔Au@Pd纳米核壳结构的“适配体
‑
抗体”三明治型AFB1电化学检测试剂盒，包括：GCE、HAuCl4、柠檬酸三钠、MWCNTs、CMK
‑
3、壳聚糖、HDPC、K2PdCl4、AA、Aptamer、Antibody、Tb、MCH、超纯水、无水乙醇、冰醋酸、PBS缓冲液。
[0008]进一步，部分原料使用时需配制成溶液，其中，HAuCl4溶液的浓度为1mM或10mM，柠檬酸三钠溶液的浓度为38.8mM，AA溶液的浓度为100mM，K2PdCl4溶液的浓度为10mM，Aptamer溶液的浓度为1μM，MCH溶液的浓度为2mM，Antibody溶液的浓度为50μg/mL，醋酸溶液的质量分数为2％，PBS缓冲液的浓度为0.1M(pH＝7.4)。
[0009]Aptamer的序列为5
′‑
SH
‑
(CH2)6‑
GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCTTCGCTAGGCCCACA
‑3′
。
[0010]本专利技术的技术方案之一是：一种检测AFB1的方法，包括以下步骤：
[0011](1)将MWCNTs/CMK
‑
3/AuNPs纳米复合材料滴加到GCE表面，反应；
[0012](2)将适配体Aptamer滴加到步骤(1)电极表面，反应；
[0013](3)将步骤(2)电极浸泡在MCH溶液中，反应；
[0014](4)将待测样品滴加到步骤(3)电极表面，反应；
[0015](5)将Au@PdNPs
‑
Ab
‑
Tb生物偶联物滴加到步骤(4)电极表面，反应；
[0016](6)将步骤(5)电极置于PBS缓冲液中测量电化学信号。
[0017]进一步，MWCNTs/CMK
‑
3/AuNPs纳米复合材料的制备方法为：
[0018]将50mL1mM HAuCl4溶液加热至沸腾；然后加入10mL38.8mM柠檬酸三钠溶液，保持沸腾，直至溶液颜色不再变化，冷却至室温，收集得到AuNPs悬浮液；将4.8mg MWCNTs、4.8mg CMK
‑
3和19.2mg壳聚糖分散在4mL质量分数2％醋酸溶液中，冰水浴超声处理，获得均匀分散的纳米材料混合液，最后将4mLAuNPs悬浮液加入到4mL纳米材料混合液中，并将整个混合体系继续超声处理，获得均匀分散的MWCNTs/CMK
‑
3/AuNPs纳米复合材料。
[0019]进一步，Au@PdNPs
‑
Ab
‑
Tb生物偶联物的制备方法为：
[0020]①
将0.1g HDPC、0.5mL10mM HAuCl4溶液和2mL10mM K2PdCl4溶液加入25mL超纯水中，在超声条件下形成均匀的混合溶液；接着将1.5mL 100mM AA溶液加入到混合溶液中，反应，然后将反应产物Au@PdNPs离心洗涤，再分散于10mL超纯水中，得到Au@PdNPs悬浮液；
[0021]②
将20μL 50μg/mL Antibody溶液加入到1mL Au@PdNPs悬浮液中，孵育，得到Au@PdNPs
‑
Ab共轭物溶液；随后，将3mg Tb加入到Au@PdNPs
‑
Ab共轭物溶液中，孵育；然后，离心除去未反应的抗体Antibody和Tb，得到Au@PdNPs
‑
Ab
‑
Tb生物偶联物，用PBS缓冲液冲洗后再分散于1mL PBS缓冲液中。
[0022]进一步，步骤
①
的反应条件为：35℃黑暗条件下振荡反应3h；步骤
②
的孵育条件为：37℃条件下振荡孵育3
‑
12h。
[0023]进一步，步骤(1)、(3)
‑
(5)的反应温度为37℃，时间为30min
‑
1h；步骤(2)反应条件为：室温条件下过夜；步骤(5)为采用方波伏安法(SWV)测量电化学信号，扫描范围：
‑
0.6～0V，上升电位为0.004V，脉冲振幅为0.025V，频率为15Hz。
[0024]进一步，GCE先进行预处理，预处理方法为：将GCE打磨至镜面，清洗，吹干，备用。
[0025]本专利技术的技术方案之一是：一种上述试剂盒在检测黄曲霉毒素B1中的应用。
[0026]本专利技术检测方法原理示意图如图1所示。
[0027]本专利技术的有益效果：
[0028]1、利用MWCNTs/CMK
‑
3/AuNPs纳米复合材料作为基底材料，为硫醇化的适配体提供大量结合位点；多孔的Au@Pd核壳纳米结构作为纳米载体能负载大量捕获探针Ab和电活性物质Tb。通过抗体和适配体对靶标的高亲和力，可以准确捕获AFB1。由于抗体
‑
抗原的特异性识别，大量示踪剂Au@PdNPs
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于多孔Au@Pd纳米核壳结构的“适配体
‑
抗体”三明治型AFB1电化学检测试剂盒，其特征在于，包括：GCE、HAuCl4、柠檬酸三钠、MWCNTs、CMK
‑
3、壳聚糖、HDPC、K2PdCl4、AA、Aptamer、Antibody、Tb、MCH。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括超纯水、无水乙醇、冰醋酸、PBS缓冲液。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，部分原料使用时需配制成溶液，其中，HAuCl4溶液的浓度为1mM或10mM，柠檬酸三钠溶液的浓度为38.8mM，AA溶液的浓度为100mM，K2PdCl4溶液的浓度为10mM，Aptamer溶液的浓度为1μM，MCH溶液的浓度为2mM，Antibody溶液的浓度为50μg/mL，醋酸溶液的质量分数为2％，PBS缓冲液的浓度为0.1M(pH＝7.4)；Aptamer的序列为5
′‑
SH
‑
(CH2)6‑
GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCTTCGCTAGGCCCACA
‑3′
。4.一种利用权利要求1
‑
3任一项所述试剂盒检测AFB1的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将MWCNTs/CMK
‑
3/AuNPs纳米复合材料滴加到GCE表面，反应；(2)将适配体Aptamer滴加到步骤(1)电极表面，反应；(3)将步骤(2)电极浸泡在MCH溶液中，反应；(4)将待测样品滴加到步骤(3)电极表面，反应；(5)将Au@PdNPs
‑
Ab
‑
Tb生物偶联物滴加到步骤(4)电极表面，反应；(6)将步骤(5)电极置于PBS缓冲液中测量电化学信号。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，MWCNTs/CMK
‑
3/AuNPs纳米复合材料的制备方法为：将50mL 1mM HAuCl4溶液加热至沸腾；然后加入10mL 38.8mM柠檬酸三钠溶液，保持沸腾，直至溶液颜色不再变化，冷却至室温，收集得到AuNPs悬浮液；将4.8mg MWCNTs、4.8mg CMK
‑
3和19.2mg壳聚糖分散在4mL质量分数2％醋酸溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨怀霞，刘增辉，周世瑾，宋安琪，薛金燕，刘艳菊，
申请(专利权)人：河南中医药大学，
类型：发明
国别省市：