一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法技术

本发明专利技术公开了一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法，包括如下步骤：以磷酸盐柱[5]芳烃PP5作为主体，亚甲基蓝MB作为客体分子，利用二氧化钛TiO2的介导作用，构建了一种电化学生物传感器用于T4PNK活性检测；设计的DNA底物链通过形成金

【技术实现步骤摘要】
一种基于磷酸盐柱[5]芳烃测定T4多聚核苷酸激酶活性的电化学分析方法


[0001]本专利技术涉及生化分析
，具体涉及一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法。

技术介绍

[0002]T4多聚核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase,T4 PNK)是从感染了噬菌体T4中分离得到，简称T4激酶，具有5'激酶活性，可以催化ATP的γ位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3'磷酸基团的单核苷酸的5'羟基转移，与DNA重组、复制以及损伤修复等正常细胞活动息息相关。此外，T4 PNK还是一种重要的分子生物学工具，T4 PNK的发现和应用在一定程度上促进了分子生物学的发展。目前，T4 PNK已经成为基因工程和生物分析研究中一种不可或缺的工具酶，并且进一步用于核酸损伤修复和酶抑制剂的研究。因此，测定T4 PNK的活性在生物化学及分子生物学领域都有重要意义。
[0003]柱芳烃(pillararene)是一类结构新颖的芳香族大环化合物，具有刚性的柱状结构，是继冠醚、环糊本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)设计DNA寡核苷酸序列：所述的DNA底物链具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；(2)合成磷酸盐柱[5]芳烃：以1,4
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二(2
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羟基乙氧基)苯为原料，采用艾伯佐夫反应和麦肯纳反应合成磷酸盐柱[5]芳烃；(3)构建电化学生物传感器：DNA底物链通过形成金
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硫键固定在金电极表面，MCH封闭，当存在ATP和T4 PNK时，DNA底物链末端羟基被磷酸化，以TiO2纳米粒子作为介导，将磷酸盐柱[5]芳烃连接到电极表面，磷酸盐柱[5]芳烃与亚甲基蓝通过主体和客体识别作用发生络合，实现电化学响应信号放大；(4)测定T4多核苷酸激酶活性：使用电化学工作站以三电极体系进行测试，采用微分脉冲伏安法DPV进行定量，绘制DPV峰电流与T4 PNK活性关系的标准曲线；(5)测定T4多核苷酸激酶抑制剂；所述的T4多核苷酸激酶抑制剂为(NH4)2SO4和NaH2PO4；(6)实际样品测定：所述的实际样品为HeLa细胞。2.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(2)中，磷酸盐柱[5]芳烃合成：称取10g化合物1(1,4
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二(2
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羟基乙氧基)苯)和32g三苯基膦放入烧杯中，加入200mL乙腈，氮气保护下逐滴加入四溴化碳溶液(40g四溴化碳溶于50mL乙腈)，室温下反应时间为5
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6h，注入冰水后，得到白色晶体，晶体过滤后用石油醚/甲醇溶液洗涤，所述的石油醚与甲醇溶液的体积比为1:1，制得化合物2；称取1.6g化合物2和0.4g多聚甲醛放入烧杯中，加入20mL1,2
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二氯乙烷，氮气保护下逐滴加入0.6mL三氟化硼乙醚溶液，室温下反应时间为6
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7h，加水淬灭，用饱和食盐水萃取，收集下层有机相，有机相经无水硫酸钠干燥、减压浓缩、柱层析纯化，所述的石油醚与二氯甲烷的体积比为1:1，得到化合物3；称取2.5g化合物3和25g亚磷酸三乙酯放入烧瓶中，氮气保护下165℃搅拌，搅拌时间为70
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80h，减压浓缩，柱层析纯化，所述的甲醇与乙酸乙酯的体积比为1:2，得到化合物4；称取3g化合物4溶于50mL二氯甲烷，0℃和氮气保护下，加入14g三甲基溴硅烷，室温下搅拌，搅拌时间为70
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80h，减压蒸馏纯化后，加入30mL水搅拌，搅拌时间为0.5
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1h，浓缩干燥得到固体，固体用丙酮洗涤后得到化合物5；称取0.5g化合物5溶于200mL 30％氨水，室温下搅拌，搅拌时间为70
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80h，旋转干燥，得到最终产物磷酸盐柱[5]芳烃。3.根据权利要求1所述的基于磷酸盐柱[5]芳烃和亚甲基蓝主体和客体识别作用测定T4多聚核苷酸激酶活性的方法，其特征在于：在步骤(3)中，在预处理好的金电极表面滴涂5μL 1μM DNA底物链溶液，30℃下孵育2h，在1mM MCH溶液中孵育15min，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳丽，刘在琼，张英琴，保秋连，杨丽娟，王红斌，庞鹏飞，
申请(专利权)人：云南民族大学，
类型：发明
国别省市：